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基于选择清除分析鉴定影响枣果实大小的基因

杨柳 周鹤莹 薄文浩 李颖岳 庞晓明

杨柳, 周鹤莹, 薄文浩, 李颖岳, 庞晓明. 基于选择清除分析鉴定影响枣果实大小的基因[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
引用本文: 杨柳, 周鹤莹, 薄文浩, 李颖岳, 庞晓明. 基于选择清除分析鉴定影响枣果实大小的基因[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
Yang Liu, Zhou Heying, Bo Wenhao, Li Yingyue, Pang Xiaoming. Identification of genes related with jujube fruit size based on selective sweep analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
Citation: Yang Liu, Zhou Heying, Bo Wenhao, Li Yingyue, Pang Xiaoming. Identification of genes related with jujube fruit size based on selective sweep analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097

基于选择清除分析鉴定影响枣果实大小的基因

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
基金项目: 国家重点研发项目(2018YFD1000607),2017年农业部华北都市农业重点实验室开放课题(kf2017015),北京林业大学热点追踪项目(2018BLRD)
详细信息
    作者简介:

    杨柳。主要研究方向:经济林木遗传育种。Email:991916694@qq.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    庞晓明,教授,博士生导师。主要研究方向:经济林遗传育种。Email:xmpang@163.com 地址:同上

  • 中图分类号: S665.1

Identification of genes related with jujube fruit size based on selective sweep analysis

  • 摘要: 目的通过全基因组水平上比较大果型和小果型两种类型枣品种间遗传多样性水平,检测基因组的选择清除区域,以期鉴定影响枣果实大小的潜在相关基因,为解析枣果实大小差异形成的分子机制奠定基础。方法本研究通过利用12个大果类型枣品种和25个小果类型枣品种群体的简化基因组测序,获得SNP标记后进行主成分和遗传多样性分析,解析枣品种的群体遗传关系;同时,基于遗传分化系数(Fst)和核苷酸多态性(π)进行选择信号检测,进一步对受选择区域所包含的基因进行基因功能及通路的生物信息学分析,并对其中与细胞周期调节以及激素相关的基因在‘桐柏大枣’和酸枣果实中的相对表达量进行了比较分析。结果共获得130 077个高质量的SNPs,大果群体的遗传多样性(π:0.32)低于小果群体(π:0.33),大果和小果群体分别检测到83和149个受选择基因。通过基因的功能注释和富集分析,我们确定了6个参与细胞周期或激素合成调控途径的候选基因(LOC107404981、LOC107406728、LOC107424132、LOC107426306、LOC107418232、LOC107432595)。qRT-PCR检测发现,LOC107424132、LOC107426306、LOC107418232、LOC107432595表达量在花后75天增加,候选基因LOC107404981、LOC107406728的表达量在花后45天和75天显著增加。进一步分析发现这些候选基因在枣品种和酸枣之间存在差异表达。结论结果表明LOC107404981、LOC107406728基因可能与枣果实大小的分子调控有关,为进一步揭示该基因的调控机制奠定了基础。
  • 图  1  大果和小果群组亲缘关系分析

    PC代表主成分。PC represents principal component.

    Figure  1.  Large and small jujube groups genetic analysis

    图  2  大果和小果群组连锁不平衡(LD)的衰退曲线图

    Figure  2.  Decline graph of linkage disequilibrium (LD) in large and small jujube groups

    图  3  大果和小果群组中具有强选择性扫描信号的基因组区域

    Pi_ratio((L)θπ/(S)θπ)和Fst值,以10 kb步长滑动的100 kb窗口中计算。Distribution of Pi_ratio ((L)θπ/(S)θπ) and Fst values were calculated in 100 kb windows sliding in 10 kb steps.

    Figure  3.  Genomic regions with strong selective sweep signals in large and small jujube groups

    图  4  候选基因在6个果实发育时期的基因表达分析

    Figure  4.  qRT-PCR analysis of candidate genes in six fruit development stages after flowering

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    , 严晓素, 赵兵, 骈瑞琪, 刘玉军, 王华芳, 尹伟伦, 邹坤, 王玉兵, 王建中, 温秀凤3, 吴坚, 谢磊, 冯仲科, 冯晓峰, 李凯, 王瑛, 张庆, 陶凤杰, 陈卫平, 沈应柏, 李镇宇, 李凤兰, 丁霞, 王民中, 刘艳, 张兴杰, 呼晓姝, 杨伟光, 刘玉军, 孙建华, 王玉春, 林善枝, 付瑞海, 马建海, 汪植, 赵新丽, 蒋平.  阜新沙棘杂种无性系果实性状对比研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 160-164.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-02-28
  • 修回日期:  2019-03-07
  • 网络出版日期:  2019-10-10
  • 刊出日期:  2019-10-01

基于选择清除分析鉴定影响枣果实大小的基因

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
    基金项目:  国家重点研发项目(2018YFD1000607),2017年农业部华北都市农业重点实验室开放课题(kf2017015),北京林业大学热点追踪项目(2018BLRD)
    作者简介:

    杨柳。主要研究方向:经济林木遗传育种。Email:991916694@qq.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 庞晓明,教授,博士生导师。主要研究方向:经济林遗传育种。Email:xmpang@163.com 地址:同上
  • 中图分类号: S665.1

摘要: 目的通过全基因组水平上比较大果型和小果型两种类型枣品种间遗传多样性水平,检测基因组的选择清除区域,以期鉴定影响枣果实大小的潜在相关基因,为解析枣果实大小差异形成的分子机制奠定基础。方法本研究通过利用12个大果类型枣品种和25个小果类型枣品种群体的简化基因组测序,获得SNP标记后进行主成分和遗传多样性分析,解析枣品种的群体遗传关系;同时,基于遗传分化系数(Fst)和核苷酸多态性(π)进行选择信号检测,进一步对受选择区域所包含的基因进行基因功能及通路的生物信息学分析,并对其中与细胞周期调节以及激素相关的基因在‘桐柏大枣’和酸枣果实中的相对表达量进行了比较分析。结果共获得130 077个高质量的SNPs,大果群体的遗传多样性(π:0.32)低于小果群体(π:0.33),大果和小果群体分别检测到83和149个受选择基因。通过基因的功能注释和富集分析,我们确定了6个参与细胞周期或激素合成调控途径的候选基因(LOC107404981、LOC107406728、LOC107424132、LOC107426306、LOC107418232、LOC107432595)。qRT-PCR检测发现,LOC107424132、LOC107426306、LOC107418232、LOC107432595表达量在花后75天增加,候选基因LOC107404981、LOC107406728的表达量在花后45天和75天显著增加。进一步分析发现这些候选基因在枣品种和酸枣之间存在差异表达。结论结果表明LOC107404981、LOC107406728基因可能与枣果实大小的分子调控有关,为进一步揭示该基因的调控机制奠定了基础。

English Abstract

杨柳, 周鹤莹, 薄文浩, 李颖岳, 庞晓明. 基于选择清除分析鉴定影响枣果实大小的基因[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
引用本文: 杨柳, 周鹤莹, 薄文浩, 李颖岳, 庞晓明. 基于选择清除分析鉴定影响枣果实大小的基因[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
Yang Liu, Zhou Heying, Bo Wenhao, Li Yingyue, Pang Xiaoming. Identification of genes related with jujube fruit size based on selective sweep analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
Citation: Yang Liu, Zhou Heying, Bo Wenhao, Li Yingyue, Pang Xiaoming. Identification of genes related with jujube fruit size based on selective sweep analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(10): 30-36. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190097
  • 枣(Ziziphus jujuba)(2n = 2x = 24)隶属于鼠李科(Rhamnaceae),枣果是重要的干鲜兼用传统食品。人类常根据自身的需要,有目的的驯化植物,选择适合的口味、大小、色泽等,有益性状被保留下来且不断积累,逐渐形成了栽培种(类型)。枣的果实大小已成为人类选择的目标,显著影响了消费者的选择。不同品种的枣果实大小差异很大,大多数酸枣(Z. jujuba var. spinosa)在2 g左右,而有的枣品种果重达50 g。这些差异可能是基因组上的某些位点受到长期的人工选择变异积累而导致的。具有差异性选择信号的位点很可能与特定环境的适应以及控制重要农艺性状的基因座相关[1]。鉴定调控枣果实大小的相关基因或者SNP位点,对于解析其调控的分子机制和枣分子育种具有重要意义。

    物种驯化和育种使物种向着既适应特定生态环境又满足人类需要的方向发展[2]。在长时间的人工选择下,目标性状关联的等位基因在群体中的频率增加,而邻近区域的遗传变异会受到影响,与最近固定的有益突变相关区域的变化表示“选择性扫描”[3-4]

    随着基因组测序技术的快速发展,大量作物和果树的基因组得以解析,从全基因组水平进行选择驯化的研究取得了显著进展。如,棉花(Gossypium hirstum)抗病性和产量性状受选择更强[5];调节种子脱落性状受到更多关注[6];基因组控制胡椒(Piper nigrum)果实减缓和软化的过程被选择[7];控制种子重量和含油量的数量性状基因座受选择性较强[8];苹果(Malus pumila)的酸度而不是甜度受人工选择的影响[9];枣果酸甜味是受人为驯化选择的[10]

    目前常用的选择性清除检验方法主要有基于突变频率分布的Tajima’s D检验[11],基于SNP数据集的群体交叉复合似然比例法(XP-CLR)[12],基于核苷酸差异性的π法[13],采用卡方检验的HKA检验[14],成对的群体分化指标Fst[15],以及基于连锁不平衡的方法[16]等。

    本研究利用37份枣种质的GBS数据,共获得130 077个高质量SNPs,进一步分析了群体的主成分和遗传多样性水平以及连锁不平衡模式,借助遗传分化系数Fst和核苷酸差异π法,鉴定选择清除区域(selective sweeps),并进行GO注释和KEGG通路富集分析,对其中与激素调节、细胞增殖或细胞扩增过程相关的重要候选基因进行表达量研究,以期获得与调控果实大小相关的候选基因,为研究枣果大小调控的分子机制和分子育种提供参考。

    • 本研究选择37份枣种质,其中大果型(L)组有12份种质,单果质量均大于15 g(标准差:3.071 9 g);小果型(S)组25份种质,单果质量均小于5 g(标准差:0.863 3 g),每份种质的单果质量参见陈武[17]的文章。以种植在山西太谷国家枣种质资源圃(37°23′ N、112°32′ E)的‘桐柏大枣’(Z. jujuba ‘Tongbaidazao’)和酸枣分别作为大果枣和小果枣的代表,分别于花后15、25、45、55、75、85 d后采集果实,每个时期设3次重复,液氮速冻后置于− 80 ℃冰箱中保存。

    • 本研究中37份枣种质的DNA提取、GBS建库和测序参考文献[18]。

      编写C语言脚本去除低质量序列和接头后,对测序数据做进一步过滤,过滤标准为:(1)质量过滤:窗口大小设置为5 bp,步长设置为1 bp;(2)长度过滤:若双末端中任意一条reads的长度 ≤ 50 bp,则去除该双末端reads。

    • 采用bwa[19](版本0.7.12)mem程序以默认参数将过滤后数据比对到冬枣参考基因组(ZizJuj_1.1)[20]

    • 比对后使用GATK[21](版本3.8)进行SNP检测,SNP过滤标准如下:(1)Fisher test of strand bias(FS)≤ 60;(2)HaplotypeScore ≤ 13.0;(3)Mapping Quality(MQ)≥ 40;(4)Read Depth(DP)≥ 148。此外,除去次要等位基因(MAF)频率小于0.05的SNP。用ANNOVAR(版本2016-02-01)进一步注释鉴定的SNPs,注释结果分为基因间区域,外显子区域和内含子区域等。

    • 基于获得的SNP数据进行枣品种的遗传关系分析。采用FastTree[22](版本2.1.10)软件中的generalized time-reversible model(GTR模型)构建系统发育树,之后对系统发育树分支的可靠性进行验证(bootstrap,1 000 replications)。主成成分分析采用GCTA(http://www.complextraitgenomics.com/software/gcta/)软件。

    • 连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)采用PopLDdecay(版本3.30)软件计算SNP之间的r2。使用Stacks软件(版本1.46)中的Populations命令计算如下统计数据:(1)观测杂合度(Ho),(2)期望杂合度(He),(3)核苷酸多样性(π),(4)近交系数(Fis)。

    • 使用遗传分化系数(Fst)和核苷酸多态性参数θπ((L)θπ/(S)θπ)方法进行sweeps选择分析。使用经验程序和选择窗口同时具有极端低或高θπ比率(5%左尾和95%右尾,此时,θπ值分别为0.55和1.65)和显著高的Fst值的区域(Fst占前5%的部分,即Fst值大于0.08)作为基因组具有强选择性扫描信号的区域[23]

    • 对鉴定的清除区域,使用Interproscan软件进行基因本体论(GO)注释,并使用网站(http://plantregmap.cbi.pku.edu.cn/go.php)进行相应的GO富集分析(P ≤ 0.05)。进一步进行KO(KEGG Ortholog and Pathway)注释,其主要基于KEGG的KAAS自动注释系统,其中基因组选择“植物”,并选择双向最佳命中(BBH)作为KO的判别规则。完成后,KO被映射到相应的KEGG通路途径。KOBSA(版本3.0)用于KEGG富集分析,结果基于Fisher精确检验获得,错误发现率(FDR)由Benjamini-Hochberg方法控制。

    • 使用植物RNA提取试剂盒(Omega)提取‘桐柏大枣’和酸枣6个发育时期果实(15、25、45、55、75、85 d)的总RNA。使用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)进行cDNA的反转录。反转录为20 μL体系,第一步(10 uL):包括4 μL总RNA,l μL dNTP Mix ture,0.5 μL Oligo dT Primcr,0.5 μL Random 6 Primers,4 μL RNase Free dH20,反应条件为65 ℃ 5 min,冰上急冷2 min;第二步(20 μL):包括上述反应液10 μL,4 μL 5 × PrimeScript ⅡBuffer,0.5 μL RNase Inhibitor,1 μL PrimeScriptⅡRTase,4.5 μL RNase Free dH2O,反应条件:42 ℃ 50 min,95 ℃ 5 min。反转录产物4 ℃保存备用。

      qRT-PCR采用Prism 7500 FAST Real-time PCR System(Applied Biosystems)和TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)进行分析。反应体系10 μL:5 μL SYBR,3.5 μL ddH2O,1 μL模板和引物各0.25 μL。反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,采集信号40个循环,基线和阈值循环(Ct)由系统软件自动确定,收集荧光,绘制熔解曲线,温度由55 ℃开始至99 ℃终止。所有实验进行3次重复。将转录物水平相对于Zjactin基因的平均表达标准化(GenBank:EU916201)。根据2− ΔΔCt方法计算相对基因表达水平[24]

    • 通过对原始数据进行质量控制和过滤,共获得130 077个高质量SNPs。对获得的SNP进行变异类型统计发现:共有82 199次转换(ts)和47 878次颠换(tv),ts/tv比率为1.72。对SNP注释可见,51.25% SNP位于基因间区域,21.29%位于编码序列中。在后者中,有3 822个同义替换和4 417个非同义替换SNP,非同义替换与同义替换的比率为1.16。当非同义和同义核苷酸替换的比率 > 1时,表明枣种质受到正向选择[25]

    • 图1A系统发育树和图1B主成分分析结果显示,大果和小果群组间区分不明显,遗传分化比较低。系统发育树结果和主成分分析一致,两个群体区分不明显,序列相似性较高,具有相近的遗传关系。

      图  1  大果和小果群组亲缘关系分析

      Figure 1.  Large and small jujube groups genetic analysis

      小果枣种质的核苷酸多样性(π)(0.33)略高于大果种质(0.32)。在L和S群组中观测杂合度(Ho)分别为31.39%和31.99%,期望杂合度(He)分别为30.49%和31.95%。此外,L群组中的平均近交系数(Fis)(0.03)显著低于S群组(0.06)。

      图2所示,LD程度随着标记距离的增大而衰减,并且LD的变异程度也随之减少。可以发现,两个群体衰减程度最快时,其平均距离约为15 kb;L群组的最大LD值为0.583 0,当LD衰减到其最大值的一半时,平均距离约为2.05 kb;S群组的最大LD值为0.476 7,LD衰减到其最大值一半的平均距离约为1.011 kb。S群组具有较快的连锁不平衡衰减速度,可能更偏向于野生种质[26]

      图  2  大果和小果群组连锁不平衡(LD)的衰退曲线图

      Figure 2.  Decline graph of linkage disequilibrium (LD) in large and small jujube groups

    • 图3显示,小果枣种质具有较高的多态性水平(平均(L)θπ/(S)θπ = 0.9)。在S群组中,检测到受强选择的区域约为2 268 Kb,占基因组的0.64%,含有149个基因;L群组中约为848 Kb,占基因组的0.203%,含有83个基因被鉴定为选择信号。

      图  3  大果和小果群组中具有强选择性扫描信号的基因组区域

      Figure 3.  Genomic regions with strong selective sweep signals in large and small jujube groups

      为了进一步分析这些基因的功能,我们对其进行GO注释和KEGG富集分析。S群组中3个最显著富集(P < 0.05)的代谢通路分别是磷代谢过程(GO:0006793),含磷酸盐的化合物代谢过程(GO:0006796),磷酸化过程(GO:0016310);在L群组中,茉莉酸介导的信号传导途径(GO:0009867)、对茉莉酸刺激的细胞应答途径(GO:0071395)、细胞周期的调节(GO:0051726)和脂质代谢途径(GO:0006629)为显著富集通路。在分子功能中,作用于供体CH-CH组(GO:0016627)的钙离子结合通路(GO:0005509)和氧化还原酶活性通路分别是S和L群组中最重要的通路。此外,L和S群组受选择的基因分别映射到46和59个通路途径。其中,L和S群组中最显著的KEGG通路是s-甲基-5-硫代-α-D-核糖1-磷酸酯降解(P = 0.000 461)和生物素代谢(P = 0.004 512)通路。

    • 为筛选与枣果实大小形成相关的候选基因,基于232个选择信号基因的功能注释和富集分析,我们选择了参与细胞周期或激素合成调控途径的基因,即GO:0009867(P = 0.010 8),GO:0071395(P = 0.011 2),GO:0051726(P = 0.022 7)和GO:1903046(P = 0.049 79),筛选到6个候选基因(LOC107404981、LOC107406728、LOC107424132、LOC107426306、LOC107418232、LOC107432595)。

      图4可见,6个候选基因在‘桐柏大枣’中的表达量普遍高于在酸枣中的表达量。此外,LOC107424132、LOC107426306、LOC107418232、LOC107432595基因在花后75 d表达量开始增加;而LOC107404981、LOC107406728基因的表达模式不同,表达量增加最多的是在花后45 d和75 d。先前的研究表明,枣果实大小发育有两个快速增长期,一个是开花后25 ~ 45 d,另一个是开花后65 ~ 85 d[27]。此外,在6个候选基因中,LOC107406728(NC_029679.1:40855001-40873000)和LOC107404981(NW_015453831.1:16001-24000)(含有茉莉酮酸酯(ZIM)结构域蛋白)分别显著富集在细胞周期调控途径(GO:0051726)和植物激素信号转导通路(K13464),并且注释为茉莉酸(JA)介导的信号传导途径(GO:0009867)和对JA刺激的细胞应答途径(GO:0071395)。因此,这两个基因可能在果实大小的调控过程中发挥重要作用。

      图  4  候选基因在6个果实发育时期的基因表达分析

      Figure 4.  qRT-PCR analysis of candidate genes in six fruit development stages after flowering

    • 本研究利用130 077个高质量的SNPs进行了两种类型枣种质的遗传多样性和连锁不平衡程度的研究,枣的非同义替换与同义替换的比率为1.16,表明枣经历了人工的正向选择。枣的非同义/同义替换的比率普遍低于大豆(Glycine max)(1.6)[28],番茄(Lycopersicon esculentum)(1.45)[29],水稻(Oryza sativa)(1.29)[30]。选择清除信号检测能揭示出受到选择作用的基因组区域,这些由于选择造成的基因痕迹很大程度上与生物进化过程中的表型特征相关,所以可以通过选择信号进行基因挖掘。然而,基因组水平选择信号的检测方法本身均基于一定的假设,如果实际情况与这些假设相背离,这些方法可能会产生假阳性的结果。因此综合利用不同的检测方法有利于提高检测的有效性和降低假阳性。

      果实大小是一个重要的果实质量指标,找到控制果实大小的基因对于经济果树产量的调控研究具有重要意义。果实大小主要是由细胞数目和细胞大小决定,这是细胞增殖和细胞扩增的结果[31]。该过程受植物激素和细胞周期等相关因素的影响。例如,已有研究证明细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶影响细胞的分裂和生长;细胞色素P450(KLUH/CYP78A5)、生长素诱导因子、APETALA2/乙烯响应因子(AP2/ER)和赤霉素20氧化酶(GA20OX)能够使器官增大[32]。植物激素调节细胞分裂和增殖,促进细胞数量增加和细胞增大,最终促进果实生长。茉莉酸作为一种重要的植物激素,在植物体中分布广泛,其生理作用与植物的生长发育有关,且影响着该途径上的其他激素水平。前人研究表明,经茉莉酸处理的番茄其果实重量小于野生型[33]。结合我们的实验结果,推测LOC107404981可能通过植物激素途径参与调控果实的大小。LOC107406728是细胞周期蛋白之一,已有研究发现细胞周期蛋白参与细胞增殖[34],且能够调节细胞的生长和死亡,但具体的作用方式和分子机制需要进一步的研究。

参考文献 (34)

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