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基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析

潘丽芹 李纪元 李绍翠 范正琪 殷恒福 何丽波

潘丽芹, 李纪元, 李绍翠, 范正琪, 殷恒福, 何丽波. 基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
引用本文: 潘丽芹, 李纪元, 李绍翠, 范正琪, 殷恒福, 何丽波. 基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
Pan Liqin, Li Jiyuan, Li Shaocui, Fan Zhengqi, Yin Hengfu, He Libo. Development of SSR markers based on transcriptome of Camellia japonica and analysis of genetic relationship[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
Citation: Pan Liqin, Li Jiyuan, Li Shaocui, Fan Zhengqi, Yin Hengfu, He Libo. Development of SSR markers based on transcriptome of Camellia japonica and analysis of genetic relationship[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101

基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
基金项目: 浙江省农业(林木)新品种选育重大科技专项(2016C02056-12),政府间国际科技创新合作重点专项(2016YFE0126100)
详细信息
    作者简介:

    潘丽芹,副教授。主要研究方向:园林植物分子育种。Email:826673874@qq.com 地址:318020浙江省台州市黄岩区嘉木路288号台州科技职业学院

    通讯作者:

    李纪元,研究员,博士生导师。主要研究方向:园林植物分子育种。Email:jiyuan_li@126.com 地址:311400浙江省杭州市富阳区大桥路73号中国林业科学研究院亚热带林业研究所

    何丽波,副教授。主要研究方向:风景园林。Email:helibo@hunau.edu.cn 地址:410128湖南省长沙市芙蓉区农大路1号湖南农业大学园艺园林学院

  • 中图分类号: S667.5; S794.9

Development of SSR markers based on transcriptome of Camellia japonica and analysis of genetic relationship

  • 摘要: 【目的】开发基于山茶转录组的EST-SSR分子标记,并应用该标记进行山茶种质的亲缘关系分析。【方法】本研究以山茶叶片转录组测序所获得的50 518条Unigenes为背景数据,利用MISA软件搜索SSR标记,设计并筛选SSR多态性引物,对8份山茶种质进行了UPGMA聚类。【结果】共检索到13 197个SSR位点,SSR的发生频率和分布频率分别为19.52%、26.12%,平均分布距离为4.33 kb;在6种SSR重复类型中,以单、二、三核苷酸这3种重复类型为主,分别占48.420%、34.917%和15.473%;出现频率高的基序类型为A/T、AG/CT和AT/TA,占总SSR位点的79.61%;三核苷酸中以AAG/CTT、ACC/GGT、AAT/ATT类型居多;在设计出的10 974对引物中,随机选用其中90对引物进行多态筛选,73对引物扩增产物与预期大小一致,有效扩增率为81.11%,29对引物存在扩增多态性,占39.73%。扩增得到72个等位基因,有效等位基因数平均达到3.264;观察杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.208和0.638,引物多态信息含量平均为0.496;8份山茶种质在相似系数为0.58时,可以分为4类:山茶原种为Ⅰ类,‘黑蛋石’、‘红叶黑魔法’和‘黑骑士’为Ⅱ类,‘黑魔法’和‘金华美女’分别为Ⅲ类和Ⅳ类。【结论】山茶转录组测序的Unigenes信息可作为SSR标记开发的有效来源,为山茶的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及分子标记辅助育种等奠定了一定的理论基础。
  • 图  1  山茶‘红叶黑魔法’转录组中SSR重复次数分布

    Figure  1.  Distribution of SSR repeats frequency in C. ‘Red Leaved Black Magic’ transcriptome

    图  2  山茶转录组SSR的基序类型分布

    A、B、C分别表示单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复的基元比例。A, B, C, reperesent the ratio of mono-nucleotide repeats, di-nucleotide repeats and tri-nucleotide repeats in Camellia.

    Figure  2.  Distribution of SSR types in Camellia

    图  3  引物32对8份山茶种质的PCR扩增信号图

    Figure  3.  PCR amplification signal figure of primer 32 in 8 Camellia germplasm

    图  4  8份山茶种质的UPGMA聚类图

    Figure  4.  UPGMA dendrogram for 8 Camellia samples

    表  1  山茶材料及采样地点

    Table  1.   List of Camellia collections and locations

    编号 No.名称 Genotype种源地 Origin编号 No.名称 Genotype种源地 Origin
    1 山茶
    C. japonica
    浙江杭州
    Zhejiang Hangzhou
    5 黑魔法
    C. japonica ‘Black Magic’
    浙江金华
    Zhejiang Jinhua
    2 黑蛋石
    C. ‘Black Opal’[11-13]
    浙江杭州
    Zhejiang Hangzhou
    6 黑魔法
    C. japonica ‘Black Magic’[11-13]
    浙江杭州
    Zhejiang Hangzhou
    3 红叶黑魔法
    C. ‘Red Leaved Black Magic’
    浙江杭州
    Zhejiang Hangzhou
    7 黑骑士
    C. ‘Night Rider’[11-13]
    浙江杭州
    Zhejiang Hangzhou
    4 金华美女
    C. japonica ‘Jinhua Meinǖ’[14]
    浙江杭州
    Zhejiang Hangzhou
    8 黑骑士
    C. ‘Night Rider’
    浙江金华
    Zhejiang Jinhua
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    表  2  山茶叶片转录组中SSR的分布情况

    Table  2.   Distribution of SSR loci in the transcriptome of Camellia leaves

    SSR类型 SSR type数量 Number比例 Percentage/%出现频率 Distribution frequency/%平均距离Average distance/kb
    单核苷酸 Mono-nucleotide 6 390 48.420 12.649 8.94
    二核苷酸 Di-nucleotide 4 608 34.917 9.121 12.40
    三核苷酸 Tri-nucleotide 2 042 15.473 4.042 27.97
    四核苷酸 Tetra-nucleotide 128 0.970 0.253 446.25
    五核苷酸 Penta-nucleotide 14 0.106 0.028 4 080.04
    六核苷酸 Hexa-nucleotide 15 0.114 0.029 3 808.04
    总计 Total 13 197 100 26.123 4.33
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    表  3  山茶转录组29对SSR引物信息及多态性信息

    Table  3.   29 pairs of SSR primers and polymorphic information of C. japonica transcriptome

    引物编号
    Primer No.
    来源
    Gene ID
    引物序列
    Primer sequence
    SSR基元
    SSR motif
    有效等位基因
    Effective alleles
    观察杂合度
    Observed heterozygosity
    期望杂合度
    Expected heterozygosity
    多态信息含量
    Polymorphism
    information content
    P1 c105034.graph_c0 F:CTTCTTCTCGATCCACAGCC (GAG)5 4.414 0.250 0.773 0.556
    R:CGATCTCCTCCGTAACAAGC
    P6 c123499.graph_c0 F:GGACAATCTTTTTGGGAGCA (ATT)5 1.556 0.143 0.357 0.375
    R:CCCTACACAACCAGGAAACC
    P10 c126182.graph_c0 F:CCTTAACAATCAGCAATGCC (AAC)5 3.122 0.375 0.680 0.455
    R:TGCCATGTACCACATACCCA
    P12 c129722.graph_c0 F:TCAAAAGAGACCTTGGGCTG (GTA)7 4.741 0.375 0.789 0.545
    R:GGGGACTTCCGATAACACAA
    P16 c133766.graph_c0 F:GTCCCGAAAAATCCCAAAAT (CT)6 4.235 0.500 0.764 0.778
    R:AATTTGTCTGCAATGGCTCC
    P17 c133791.graph_c0 F:TGAATCACAATCTTGGCTGG (GA)8 2.909 0.500 0.656 0.417
    R:GGTGGCCTAATACAAGCTGC
    P18 c133791.graph_c0 F:TGAATCACAATCTTGGCTGG (A)12 2.667 0.500 0.625 0.417
    R:GGTGGCCTAATACAAGCTGC
    P21 c134194.graph_c1 F:ATGGTGGCAAGGAATCAAAG (TGG)5 4.000 0.750 0.750 0.500
    R:TGTAAGCTCCTGTGCTGTGG
    P22 c135100.graph_c0 F:TTCCTCTTTCAAATGCCAATG (TA)6 2.844 0.125 0.648 0.333
    R:TTAACGGGGAGCCATATCAA
    P24 c135126.graph_c1 F:GTGAAACAAAGCCGGAGAGT (GA)7 5.565 0.625 0.820 0.615
    R:ACCTGGTTCAATCTATGGCG
    P25 c136711.graph_c1 F:CGTTTCAAGGGCAATATCGT (TTG)5 2.390 0.429 0.582 0.400
    R:GCTACCATGAAGCTCCAACC
    P26 c137110.graph_c0 F:AGATTTGCAAGGTTGGGTTG (GCA)6 2.579 0.286 0.612 0.375
    R:TCTACCACACTCCCACTCCC
    P28 c137365.graph_c0 F:TGGTTGCTGTTGTTGAGGAG (TGG)6 3.200 0.250 0.688 0.444
    R:CCGCCTAATCAGAACCCTTT
    P32 c138380.graph_c1 F:TCGTTAAGGCAGCTCTCGAT (CGT)7 2.723 0.750 0.633 0.286
    R:CCACCACTGTGTACGGTCAA
    P37 c141066.graph_c0 F:ACACACGAACCACTCCATCA (TAA)6 2.844 0.375 0.648 0.273
    R:TTTGGTTGTTGGCATTTTCA
    P40 c142086.graph_c0 F:AACAATACCCGACTCCTCCC (CAT)6 5.333 0.500 0.813 0.583
    R:CCTATGGCGAGACGTTCAAT
    P41 c142086.graph_c1 F:AATAGCACGGTAATCACGGC (CAT)7 4.129 0.125 0.758 0.556
    R:GAATTTTCTGGGCCATCTGA
    P42 c143100.graph_c0 F:TTCCACAATTCCCACCCTTA (ACC)5 3.200 0.250 0.688 0.500
    R:CCAGTCAAGCCCTGTAGCTC
    P44 c143532.graph_c1 F:CACCATCACCAAAGAAGGCT (CCA)6 4.455 0.429 0.776 0.600
    R:TGCAAGAATTTTAACCAAACG
    P45 c144082.graph_c1 F:AATACCTTGGCAAATGACGC (AGA)5 3.161 0.571 0.684 0.364
    R:CGCCAACCTATCTTCAAAGC
    P47 c144342.graph_c0 F:CGTCCAGCATTTCTCCATTT (TTC)6 3.122 0.125 0.680 0.556
    R:CAAGAAGGCTCTGGAGGATG
    P61 c147427.graph_c0 F:GGGGAGTAGAAGAAGGGACG (GTG)5 3.657 0.125 0.727 0.556
    R:TGATCTCTCACTCCGACACG
    P70 c148755.graph_c0 F:TGGTGGAGCTCAGAACAAGA (GGT)6 3.657 0.375 0.727 0.455
    R:TCCATTGAAGTATCCACCGC
    P71 c148777.graph_c3 F:CTCGCGTCTCAAAACTTTCC (AAG)5 2.977 0.125 0.664 0.556
    R:ATCACTGGCTCATCTCCGTC
    P75 c151957.graph_c0 F:GGGGGCAGGTTAACTTTGTT (TA)7 2.977 0.250 0.664 0.500
    R:CCCGTCCTGATCTACCTCCT
    P78 c151961.graph_c0 F:TCCCCATGTAGACTCTTCCG (CCG)5 5.818 0.750 0.828 0.500
    R:AAGACATGTTCGGTTCCGTC
    P84 c153951.graph_c1 F:CCCACATGTTTCCTCCACTT (TTA)5 3.556 0.625 0.719 0.385
    R:TAGGGCAGAATTTGGGTTTG
    P85 c154034.graph_c0 F:GCGTTGATCATGGTTTATCG (ATG)5 4.900 0.571 0.796 0.636
    R:CCGTTGATCCCTTCGACTTA
    P89 c76886.graph_c0 F:AGATCTATTGGCCACGGATG (TCT)5 4.414 0.375 0.773 0.456
    R:GTTGCGAAAAGACGAAGAGG
    平均值 Average 3.264 ± 0.158 0.208 ± 0.029 0.638 ± 0.020 0.496 ± 0.038
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    表  4  8份山茶种质的遗传相似系数

    Table  4.   Genetic similarity coefficients of 8 Camellia germplasms

    编号 No.12345678
    1 1.000 0
    2 0.260 9 1.000 0
    3 0.217 4 0.752 2 1.000 0
    4 0.449 0 0.693 9 0.489 8 1.000 0
    5 0.367 3 0.612 2 0.693 9 0.576 9 1.000 0
    6 0.347 8 0.521 7 0.565 2 0.445 0 0.671 4 1.000 0
    7 0.461 5 0.692 3 0.692 3 0.545 5 0.618 2 0.538 5 1.000 0
    8 0.375 0 0.666 7 0.625 0 0.549 0 0.627 5 0.500 0 0.814 8 1.000 0
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-26
  • 修回日期:  2019-05-26
  • 网络出版日期:  2019-07-06
  • 刊出日期:  2019-07-01

基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
    基金项目:  浙江省农业(林木)新品种选育重大科技专项(2016C02056-12),政府间国际科技创新合作重点专项(2016YFE0126100)
    作者简介:

    潘丽芹,副教授。主要研究方向:园林植物分子育种。Email:826673874@qq.com 地址:318020浙江省台州市黄岩区嘉木路288号台州科技职业学院

    通讯作者: 李纪元,研究员,博士生导师。主要研究方向:园林植物分子育种。Email:jiyuan_li@126.com 地址:311400浙江省杭州市富阳区大桥路73号中国林业科学研究院亚热带林业研究所; 何丽波,副教授。主要研究方向:风景园林。Email:helibo@hunau.edu.cn 地址:410128湖南省长沙市芙蓉区农大路1号湖南农业大学园艺园林学院
  • 中图分类号: S667.5; S794.9

摘要: 【目的】开发基于山茶转录组的EST-SSR分子标记,并应用该标记进行山茶种质的亲缘关系分析。【方法】本研究以山茶叶片转录组测序所获得的50 518条Unigenes为背景数据,利用MISA软件搜索SSR标记,设计并筛选SSR多态性引物,对8份山茶种质进行了UPGMA聚类。【结果】共检索到13 197个SSR位点,SSR的发生频率和分布频率分别为19.52%、26.12%,平均分布距离为4.33 kb;在6种SSR重复类型中,以单、二、三核苷酸这3种重复类型为主,分别占48.420%、34.917%和15.473%;出现频率高的基序类型为A/T、AG/CT和AT/TA,占总SSR位点的79.61%;三核苷酸中以AAG/CTT、ACC/GGT、AAT/ATT类型居多;在设计出的10 974对引物中,随机选用其中90对引物进行多态筛选,73对引物扩增产物与预期大小一致,有效扩增率为81.11%,29对引物存在扩增多态性,占39.73%。扩增得到72个等位基因,有效等位基因数平均达到3.264;观察杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.208和0.638,引物多态信息含量平均为0.496;8份山茶种质在相似系数为0.58时,可以分为4类:山茶原种为Ⅰ类,‘黑蛋石’、‘红叶黑魔法’和‘黑骑士’为Ⅱ类,‘黑魔法’和‘金华美女’分别为Ⅲ类和Ⅳ类。【结论】山茶转录组测序的Unigenes信息可作为SSR标记开发的有效来源,为山茶的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及分子标记辅助育种等奠定了一定的理论基础。

English Abstract

潘丽芹, 李纪元, 李绍翠, 范正琪, 殷恒福, 何丽波. 基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
引用本文: 潘丽芹, 李纪元, 李绍翠, 范正琪, 殷恒福, 何丽波. 基于山茶转录组的SSR标记开发及亲缘关系分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
Pan Liqin, Li Jiyuan, Li Shaocui, Fan Zhengqi, Yin Hengfu, He Libo. Development of SSR markers based on transcriptome of Camellia japonica and analysis of genetic relationship[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
Citation: Pan Liqin, Li Jiyuan, Li Shaocui, Fan Zhengqi, Yin Hengfu, He Libo. Development of SSR markers based on transcriptome of Camellia japonica and analysis of genetic relationship[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 111-120. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190101
  • 随着高通量测序技术的飞速发展,通过转录组数据挖掘EST-SSR(Expressed sequence tag SSR,EST-SSR))信息,能开发出大量而有效的SSR标记。由于该技术从功能基因入手,可直接反映功能基因的多样性,具有技术简便、共显性表达、重复性好、省时快速、引物开发成本低廉[1]等优点,已被广泛应用于植物种质遗传关系分析与鉴定[2]、遗传多样性分析[3]和遗传连锁图谱构建等研究领域[4-7]

    山茶(Camellia japonica)是山茶科(Theaceae)山茶属中以观赏为主要栽培目的的物种、变种和品种的统称。据记载世界茶花品种已达2.5万余种,但很多品种间形态性状相似,遗传背景不明,尤其是生产中,同名异物,同物异名现象导致品种混淆,给产业开发带来不利影响。因此利用高效的分子标记技术,对厘清种质遗传背景,鉴别品种真伪,保护品种权益则显得尤为重要。目前,SSR标记在山茶中的应用已逐步展开。如张亚利等[8]利用20对SSR引物对33份山茶属植物种质的遗传多样性进行了研究;胡兴华等[9]进行了茶花品种SSR指纹图谱构建的初步研究;李琳琳等[10]利用SSR标记技术鉴定了茶花品种杂交F1代的真伪。基于转录组测序的SSR标记在山茶中的应用研究则未见报道。本文在山茶品种‘红叶黑魔法’ (C. ‘Red Leaved Black Magic’)叶片转录组测序的基础上,利用丰富的转录组数据,深入挖掘SSR标记,同时选取花色为红、黑红,且新叶均为红叶的几份近缘种质,进行亲缘关系分析,探讨该类标记在山茶属植物研究中的应用价值,以期为山茶种质资源遗传多样性、品种鉴定、山茶属植物亲缘关系等研究提供一定的理论参考。

    • 转录组测序所用材料为山茶品种‘红叶黑魔法’叶片,样品经液氮处理后用于RNA提取,送交北京百迈客公司进行RNA-Seq转录组测序,以此为背景数据进行SSR标记的搜索与开发。选择8份山茶种质用于遗传多样性分析。于2018年3—4月间采集每份种质的幼嫩叶片,每份种质样品从3个不同植株上采样,作为3次生物学重复。经液氮速冻后带回试验室,用于基因组DNA的提取。SSR扩增所用的材料见表1

      表 1  山茶材料及采样地点

      Table 1.  List of Camellia collections and locations

      编号 No.名称 Genotype种源地 Origin编号 No.名称 Genotype种源地 Origin
      1 山茶
      C. japonica
      浙江杭州
      Zhejiang Hangzhou
      5 黑魔法
      C. japonica ‘Black Magic’
      浙江金华
      Zhejiang Jinhua
      2 黑蛋石
      C. ‘Black Opal’[11-13]
      浙江杭州
      Zhejiang Hangzhou
      6 黑魔法
      C. japonica ‘Black Magic’[11-13]
      浙江杭州
      Zhejiang Hangzhou
      3 红叶黑魔法
      C. ‘Red Leaved Black Magic’
      浙江杭州
      Zhejiang Hangzhou
      7 黑骑士
      C. ‘Night Rider’[11-13]
      浙江杭州
      Zhejiang Hangzhou
      4 金华美女
      C. japonica ‘Jinhua Meinǖ’[14]
      浙江杭州
      Zhejiang Hangzhou
      8 黑骑士
      C. ‘Night Rider’
      浙江金华
      Zhejiang Jinhua
    • 采用北京艾德莱生物科技有限公司(Aidlab Biotechnologies Co.,Ltd)植物基因组快速提取试剂盒提取植物DNA。用NanoDrop2000紫外分光光度计(Thermo Fisher公司)检测DNA浓度和纯度;1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,用于SSR标记分析。

    • 本研究利用MISA(Http://pgrc.jpk-gatersleben.de/misa/)对拼接组装得到的Unigenes进行SSR位点识别,搜索重复单元长度为1 ~ 6 bp,搜索标准为一、二、三、四、五、六核苷酸,最少重复次数分别为10、6、5、5、5、5次,复合微卫星位点之间最大间隔碱基数为100 bp。

      利用Primer 3.0软件,以SSR重复单元前后的序列进行引物设计,每个SSR位点设计出3条引物,引物序列长度18 ~ 27 bp,GC含量40% ~ 60%,退火温度55 ~ 65 ℃,预期扩增产物长度100 ~ 280 bp,尽量避免出现发夹结构和二聚体。引物设计完成后,随机挑选90对引物送擎科生物工程(杭州)有限公司合成。

    • 扩增反应在Thermal Cycler Dice PCR仪(日本)上进行。25 μL反应体系含有:50 ~ 90 ng模板DNA 2 μL,Mix 12.5 μL,引物(10 mmol/L)2 μL,蒸馏水9 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环,最后在72 ℃延伸9 min。采用Bioptic Qsep100全自动核酸分析系统(Bioptic,Inc.,台湾)进行PCR产物检测,并利用该系统自带的Bioptic Qseq100软件对SSR条带进行判读和分析。

    • 利用Bioptic Qseq100的分析和判读结果,建立原始数据矩阵。利用GenAlEx 6.501软件对山茶不同材料间的等位基因数、观察杂合度、期望杂合度及多态信息含量等进行统计;利用NTSYS-pc2.10e软件计算遗传相似系数,并构建UPGMA进化树。

    • 山茶‘红叶黑魔法’叶片转录组测序共获得213.66 Gb的Clean Data,经组装后共获得50 518条Unigenes(序列总长度为57 120 592 bp)。利用MISA软件对1 kb以上的Unigenes进行SSR搜索与分析,发现有9 859条Unigenes序列中出现了13 197个SSR位点。SSR的发生频率为19.52%,分布频率为26.12%,平均4.33 kb具有一个SSR位点。其中,6 560条Unigenes含有单个SSR位点,占含有SSR位点Unigenes总数的66.54%,3 299条Unigenes上出现了含有2个或2个以上的SSR位点,占33.46%。

      山茶叶片转录组序列中的SSR类型较为丰富,单核苷酸至六核苷酸重复类型均有出现,但以单、二、三核苷酸这3种重复类型为主,占SSR位点总数的98.81%(表2)。单核苷酸重复类型数量最大,为6 390个,占SSR位点总数的48.420%;其次是二核苷酸和三核苷酸重复类型,分别为4 608个和2 042个,占总数的34.917%和15.473%;而四、五、六核苷酸重复类型所占比例极低,仅为1.190%。出现频率最高的是单核苷酸重复序列,为12.649%,其次是二、三核苷酸重复序列,分别为9.121%和4.042%,而五、六核苷酸重复序列的出现频率最低,仅为0.028%和0.029%。山茶叶片转录组中SSR位点间的平均距离为4.33 kb。

      表 2  山茶叶片转录组中SSR的分布情况

      Table 2.  Distribution of SSR loci in the transcriptome of Camellia leaves

      SSR类型 SSR type数量 Number比例 Percentage/%出现频率 Distribution frequency/%平均距离Average distance/kb
      单核苷酸 Mono-nucleotide 6 390 48.420 12.649 8.94
      二核苷酸 Di-nucleotide 4 608 34.917 9.121 12.40
      三核苷酸 Tri-nucleotide 2 042 15.473 4.042 27.97
      四核苷酸 Tetra-nucleotide 128 0.970 0.253 446.25
      五核苷酸 Penta-nucleotide 14 0.106 0.028 4 080.04
      六核苷酸 Hexa-nucleotide 15 0.114 0.029 3 808.04
      总计 Total 13 197 100 26.123 4.33

      从SSR的重复次数来看,以6次和10次重复数量最多,分别为2 359和2 358个,占总位点的17.88%,≥ 17次重复的数量仅有181个。从图1可以看出,山茶转录组中SSR的重复次数以5 ~ 14次重复为主,占总位点数的93.33%,15 ~ 21次的重复次数仅有880个,仅占6.67%。

      图  1  山茶‘红叶黑魔法’转录组中SSR重复次数分布

      Figure 1.  Distribution of SSR repeats frequency in C. ‘Red Leaved Black Magic’ transcriptome

    • 从山茶叶片转录组SSR核苷酸基序类型来看,以单核苷酸A/T出现频率最高,达6 301次,占SSR位点总数的47.746%,占单核苷酸基序总数的98.61%,C/G则仅占1.39%(图2A)。其次是AG/CT和AT/TA基序类型,出现了3 146和1 059次,分别占SSR位点总数的23.839%和8.025%,占二核苷酸重复总数的68.27%和22.98%(图2B),上述3种基序类型是山茶转录组中SSR的主要类型,占了总SSR位点的79.61%,而CG/GC基序仅出现5次,表现出明显的偏倚性。三核苷酸重复基序中以AAG/CTT、ACC/GGT和AAT/ATT居多,分别占三核苷酸基序总数的33.40%、24.00%和17.88%,占SSR总数的11.647%(图2C)。而在四、五、六核苷酸重复中,相同基序类型出现较少,出现频率极低。

      图  2  山茶转录组SSR的基序类型分布

      Figure 2.  Distribution of SSR types in Camellia

    • 利用Primer3.0对含有SSR位点的9 859条Unigenes序列进行引物设计,共设计出10 974对引物。随机挑选90对不同重复单元(以二、三、四核苷酸为主)的引物进行PCR扩增,其中有73对引物能够扩增出与预期产物大小相符的产物,有效扩增率为81.11%。其中29对引物存在扩增多态性,占有效扩增引物的39.73%,扩增信号如图3

      图  3  引物32对8份山茶种质的PCR扩增信号图

      Figure 3.  PCR amplification signal figure of primer 32 in 8 Camellia germplasm

      利用29对多态性引物对8份山茶种质进行遗传多样性分析,共扩增得到72个等位基因。各SSR位点之间的有效等位基因数平均值为3.264,其变化范围为1.556 ~ 5.818之间。观察杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.208和0.638,引物的多态信息含量平均为0.496(表3)。

      表 3  山茶转录组29对SSR引物信息及多态性信息

      Table 3.  29 pairs of SSR primers and polymorphic information of C. japonica transcriptome

      引物编号
      Primer No.
      来源
      Gene ID
      引物序列
      Primer sequence
      SSR基元
      SSR motif
      有效等位基因
      Effective alleles
      观察杂合度
      Observed heterozygosity
      期望杂合度
      Expected heterozygosity
      多态信息含量
      Polymorphism
      information content
      P1 c105034.graph_c0 F:CTTCTTCTCGATCCACAGCC (GAG)5 4.414 0.250 0.773 0.556
      R:CGATCTCCTCCGTAACAAGC
      P6 c123499.graph_c0 F:GGACAATCTTTTTGGGAGCA (ATT)5 1.556 0.143 0.357 0.375
      R:CCCTACACAACCAGGAAACC
      P10 c126182.graph_c0 F:CCTTAACAATCAGCAATGCC (AAC)5 3.122 0.375 0.680 0.455
      R:TGCCATGTACCACATACCCA
      P12 c129722.graph_c0 F:TCAAAAGAGACCTTGGGCTG (GTA)7 4.741 0.375 0.789 0.545
      R:GGGGACTTCCGATAACACAA
      P16 c133766.graph_c0 F:GTCCCGAAAAATCCCAAAAT (CT)6 4.235 0.500 0.764 0.778
      R:AATTTGTCTGCAATGGCTCC
      P17 c133791.graph_c0 F:TGAATCACAATCTTGGCTGG (GA)8 2.909 0.500 0.656 0.417
      R:GGTGGCCTAATACAAGCTGC
      P18 c133791.graph_c0 F:TGAATCACAATCTTGGCTGG (A)12 2.667 0.500 0.625 0.417
      R:GGTGGCCTAATACAAGCTGC
      P21 c134194.graph_c1 F:ATGGTGGCAAGGAATCAAAG (TGG)5 4.000 0.750 0.750 0.500
      R:TGTAAGCTCCTGTGCTGTGG
      P22 c135100.graph_c0 F:TTCCTCTTTCAAATGCCAATG (TA)6 2.844 0.125 0.648 0.333
      R:TTAACGGGGAGCCATATCAA
      P24 c135126.graph_c1 F:GTGAAACAAAGCCGGAGAGT (GA)7 5.565 0.625 0.820 0.615
      R:ACCTGGTTCAATCTATGGCG
      P25 c136711.graph_c1 F:CGTTTCAAGGGCAATATCGT (TTG)5 2.390 0.429 0.582 0.400
      R:GCTACCATGAAGCTCCAACC
      P26 c137110.graph_c0 F:AGATTTGCAAGGTTGGGTTG (GCA)6 2.579 0.286 0.612 0.375
      R:TCTACCACACTCCCACTCCC
      P28 c137365.graph_c0 F:TGGTTGCTGTTGTTGAGGAG (TGG)6 3.200 0.250 0.688 0.444
      R:CCGCCTAATCAGAACCCTTT
      P32 c138380.graph_c1 F:TCGTTAAGGCAGCTCTCGAT (CGT)7 2.723 0.750 0.633 0.286
      R:CCACCACTGTGTACGGTCAA
      P37 c141066.graph_c0 F:ACACACGAACCACTCCATCA (TAA)6 2.844 0.375 0.648 0.273
      R:TTTGGTTGTTGGCATTTTCA
      P40 c142086.graph_c0 F:AACAATACCCGACTCCTCCC (CAT)6 5.333 0.500 0.813 0.583
      R:CCTATGGCGAGACGTTCAAT
      P41 c142086.graph_c1 F:AATAGCACGGTAATCACGGC (CAT)7 4.129 0.125 0.758 0.556
      R:GAATTTTCTGGGCCATCTGA
      P42 c143100.graph_c0 F:TTCCACAATTCCCACCCTTA (ACC)5 3.200 0.250 0.688 0.500
      R:CCAGTCAAGCCCTGTAGCTC
      P44 c143532.graph_c1 F:CACCATCACCAAAGAAGGCT (CCA)6 4.455 0.429 0.776 0.600
      R:TGCAAGAATTTTAACCAAACG
      P45 c144082.graph_c1 F:AATACCTTGGCAAATGACGC (AGA)5 3.161 0.571 0.684 0.364
      R:CGCCAACCTATCTTCAAAGC
      P47 c144342.graph_c0 F:CGTCCAGCATTTCTCCATTT (TTC)6 3.122 0.125 0.680 0.556
      R:CAAGAAGGCTCTGGAGGATG
      P61 c147427.graph_c0 F:GGGGAGTAGAAGAAGGGACG (GTG)5 3.657 0.125 0.727 0.556
      R:TGATCTCTCACTCCGACACG
      P70 c148755.graph_c0 F:TGGTGGAGCTCAGAACAAGA (GGT)6 3.657 0.375 0.727 0.455
      R:TCCATTGAAGTATCCACCGC
      P71 c148777.graph_c3 F:CTCGCGTCTCAAAACTTTCC (AAG)5 2.977 0.125 0.664 0.556
      R:ATCACTGGCTCATCTCCGTC
      P75 c151957.graph_c0 F:GGGGGCAGGTTAACTTTGTT (TA)7 2.977 0.250 0.664 0.500
      R:CCCGTCCTGATCTACCTCCT
      P78 c151961.graph_c0 F:TCCCCATGTAGACTCTTCCG (CCG)5 5.818 0.750 0.828 0.500
      R:AAGACATGTTCGGTTCCGTC
      P84 c153951.graph_c1 F:CCCACATGTTTCCTCCACTT (TTA)5 3.556 0.625 0.719 0.385
      R:TAGGGCAGAATTTGGGTTTG
      P85 c154034.graph_c0 F:GCGTTGATCATGGTTTATCG (ATG)5 4.900 0.571 0.796 0.636
      R:CCGTTGATCCCTTCGACTTA
      P89 c76886.graph_c0 F:AGATCTATTGGCCACGGATG (TCT)5 4.414 0.375 0.773 0.456
      R:GTTGCGAAAAGACGAAGAGG
      平均值 Average 3.264 ± 0.158 0.208 ± 0.029 0.638 ± 0.020 0.496 ± 0.038
    • 遗传相似系数反映了山茶种质间的亲缘关系(表4)。8份山茶种质间的相似系数为0.217 4 ~ 0.814 8。来自于不同苗圃地的2个‘黑骑士’(C. ‘Night Rider’)品种之间的遗传相似系数最大,为0.814 8,表明其确实为同名同物品种;其次是‘黑蛋石’(C. ‘Black Opal’)和‘红叶黑魔法’,为0.752 2,表明这两份种质间具有较近的亲缘关系。山茶原种与其他7份种质之间的相似系数均较低,其中与‘红叶黑魔法’‘黑蛋石’之间的值最低,分别仅为0.217 4和0.260 9。

      表 4  8份山茶种质的遗传相似系数

      Table 4.  Genetic similarity coefficients of 8 Camellia germplasms

      编号 No.12345678
      1 1.000 0
      2 0.260 9 1.000 0
      3 0.217 4 0.752 2 1.000 0
      4 0.449 0 0.693 9 0.489 8 1.000 0
      5 0.367 3 0.612 2 0.693 9 0.576 9 1.000 0
      6 0.347 8 0.521 7 0.565 2 0.445 0 0.671 4 1.000 0
      7 0.461 5 0.692 3 0.692 3 0.545 5 0.618 2 0.538 5 1.000 0
      8 0.375 0 0.666 7 0.625 0 0.549 0 0.627 5 0.500 0 0.814 8 1.000 0

      对8份山茶种质进行了UPGMA聚类(图4),可以看出,在相似系数为0.58时,8份种质可以聚为4类。山茶原种为Ⅰ类,‘黑蛋石’‘红叶黑魔法’和‘黑骑士’3份为Ⅱ类,‘黑魔法’(C. japonica ‘Black Magic’)和‘金华美女’(C. japonica ‘Jinhua Meinǖ’)分别为Ⅲ类和Ⅳ类。来自不同苗圃地的2份‘黑骑士’品种之间的相似系数最大,聚在一小类;‘红叶黑魔法’与‘黑蛋石’也被聚在一小类中。

      图  4  8份山茶种质的UPGMA聚类图

      Figure 4.  UPGMA dendrogram for 8 Camellia samples

    • 本研究中,利用MISA软件搜索到13 197个SSR位点,SSR的发生频率为19.52%,低于同属茶树(C. sinensis)的28.64%[15],油茶(C. oleifera)的26.75%[16];EST-SSR分布频率为26.12%,平均每4.33 kb出现一个SSR位点,也低于同属油茶的39.67%和2.33 kb,但高于崇左金花茶(C. chuongtsoensis)的21.90%[17]。不同植物转录组中SSR位点的出现频率各不相同,产生这种差异的原因是多方面的,一是统计参数设置引起的偏差,由于SSR的搜索标准、数据库大小以及序列的冗余级别的差异,导致统计发生频率及分布频率等参数时有所差异[18-19],更重要的是植物种间特异性可引起SSR分布频率和发生频率较大差异,如在松属(Pinus)植物研究中发现,湿地松(Pinus elliottii)SSR分布频率及发生频率分别为6.25%、5.37%[20],红松(P. koraiensis)SSR发生频率为3.74%[21],而火炬松(P. taeda)SSR分布频率仅为1.2%[22]

      核苷酸重复类型是SSR位点重要特征之一。本研究中,山茶SSR类型以单、二、三核苷酸重复类型为主,其中单核苷酸重复类型(A/T)数量最大,占重复总数的47.746%,其次是二核苷酸(AG/CT、AT/AT)和三核苷酸(AAG/CTT)重复类型,而四、五、六核苷酸重复类型很少。这与崇左金花茶[17]、柿树(Diospyros kaki[23]、马尾松(Pinus massoniana[24]、蒙古黄芪(Astragalus mongholicus[25]的研究结果较为一致,均以单核苷酸重复类型为主。而在较多的植物中,SSR重复类型是以二核苷酸、三核苷酸为主的,如桤木(Alnus cremastogyne[26]、长梗变光杜鹃(Rhododendron calvescens var. duseimatum[27]、蜡梅(Chimonanthus praecox[28]、紫鹃茶(C.sinensis var. assamica ‘Zijuan’)[29]等。导致这种差异的原因除了物种本身的基因型差异外,还可能与参数设置有关,在设置SSR搜索参数时,如未将单核苷酸重复类型设置为搜索对象,则其重复类型以二、三核苷酸为主。同一物种不同器官的转录组SSR位点特征也表现出较大的差异,由于EST-SSR以功能基因为切入点,不同器官中基因的差异表达也可导致核苷酸重复类型的不同。如茶树花的转录组序列开发出的SSR以三核苷酸重复为最多,其次是六核苷酸[30],这与茶树芽叶的转录组[16]开发的SSR以二核苷酸类型为主的试验结果是不同的。

    • PIC是用来评估基因变异程度的主要指标之一。Botstein D等[31]指出:当PIC > 0.5 时位点具有高度多态性,0.5 > PIC > 0.25时位点具有中度多态性。本研究中,利用29对多态性引物对8份山茶材料进行了遗传多样性分析,共扩增得到72个等位基因,多态信息含量(PIC)平均值为0.496。Jia等[32]利用油茶种子转录组SSR检测了18份油茶和15份山茶种质的遗传多样性,结果显示,其PIC值为0.498;李海波等[16]利用油茶叶转录组开发SSR标记,并对57份油茶样品进行了遗传关系分析,其多态信息含量为0.439 9,这些结果与本研究结果相差不大,表明基于山茶叶片转录组开发的SSR标记具有较高的可靠性。另一方面,与基因组SSR相比,本研究的PIC值要低于同属植物基因组SSR位点的多态信息含量,如低于茶树的0.51[33]、大叶茶(C. sinensis var. assamica)的0.64[34]、黔南野生茶树的0.572[35]。张亚利等[8]采用基因组SSR标记研究了茶花28份品种和金花茶(C. nitidissima)、浙江红山茶(C. chekiangoleosa)、毛花连蕊茶(C. fraterna)、微花连蕊茶(C. minutiflora)、岳麓连蕊茶(C. handelii)等种之间的遗传多样性,其PIC平均值高达0.74,远高于本研究以及他人研究中的PIC。本研究SSR位点多态性较低的原因是多方面的。首先是SSR长度,较多的研究表明,微卫星位点多态性与SSR长度存在一定的正相关[36-38]。Temnykh 等[39]认为,当SSR长度在20 bp以上时,不同品种间显示出较高的多态性,长度低于20 bp,则多态性会降低。本研究中随机选用的SSR长度大多在18 ~ 21 bp之间,可能在一定程度上低估了SSR位点的多态性。在后续的SSR标记开发中,需要选择具有较长碱基序列的SSR位点来设计引物,以提高多态性检测效率。其次,基因组SSR标记可能比来自于转录组的EST-SSR标记含有更全面的基因组信息,由于EST-SSR来自于转录区域DNA,仅反映了相关基因外显子的信息,因而比基因组DNA的多态性低[40]

    • 利用NTSYS-pc2.10e软件计算遗传相似系数,并对8份种质进行了UPGMA聚类。在相似系数为0.58处,可将8份样品聚为4类,聚类结果与这些种质的遗传背景是高度一致的。山茶原种以及山茶种内的品种‘黑魔法’和‘金华美女’,属种内实生苗变异,均各自聚成一类。‘黑蛋石’‘黑骑士’和‘红叶黑魔法’三者聚为一大类,表明三者之间遗传关系较为密切,‘黑蛋石’与‘黑骑士’均为怒江红山茶杂交种‘宝石钟’(C. hybrid ‘Ruby Bell’)与山茶‘黑椿’(C. japonica ‘Kuro-tsubaki’)的全同胞子代[11-12],聚在一小类。

      ‘红叶黑魔法’是从‘黑魔法’自由授粉子代中选育出的红叶类品种,其母本为‘黑魔法’,但其父本究竟是‘黑蛋石’,还是‘黑骑士’文献记载不清楚。本研究中可以看出,‘红叶黑魔法’与‘黑蛋石’的相似系数最大,为0.752 2,表明两者间的亲缘关系较为接近。因此,根据SSR的亲缘关系及聚类分析的结果,推测‘黑蛋石’极有可能是‘红叶黑魔法’的父本。而‘红叶黑魔法’与其母本‘黑魔法’的遗传相似系数相对较小,这一聚类结果与这3个品种的表型较为一致。从表型上看,子代‘红叶黑魔法’嫩叶叶色红艳,红叶持续时间长,其父本‘黑蛋石’的新叶为暗红色,而母本‘黑魔法’新叶仅叶尖及叶缘呈浅红色,且在叶展开后迅速转绿。另外,潘丽芹等[41]检测了这3个品种叶片的花青苷含量及比例,‘红叶黑魔法’和父本‘黑蛋石’红叶的花青苷比值分别达到87.88%和79.08%,而母本仅为42.62%。可见,子代‘红叶黑魔法’与其父本‘黑蛋石’的表型更为接近,因此,相对于母本而言,父本‘黑蛋石’对子代具有较高的遗传贡献。

    • 本研究中,以山茶转录组数据为背景材料,从50 518条Unigene序列中搜索得到13 197个SSR位点,发生频率和分布频率分别为19.52%、26.12%,平均4.33 kb存在一个SSR位点;SSR类型以单、二、三核苷酸重复类型为主;根据SSR分析结果,随机选取了90对引物进行扩增筛选,有效扩增率为81.11%,其中29对具有较好的扩增多态性,其平均多态信息含量为0.496。利用29对引物对8个山茶种质进行PCR扩增和UPGMA聚类,聚类结果与材料的遗传背景基本一致,表明利用山茶转录组数据开发的SSR标记具有较好的实用性,开发的引物可为山茶的遗传多样性研究、亲缘关系鉴定以及分子标记辅助育种等提供可靠的分子标记来源。

参考文献 (41)

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