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刺槐（Robinia pseudoacacia），为豆科（Leguminosae）刺槐属阔叶乔木，耐干旱、耐瘠薄、耐轻度盐碱、抗污染能力强、自然更新能力强，具有很好的生态和经济价值，是荒山造林和水土保持先锋树种，且具有观赏、材用、蜜源和饲用价值[1-2]。原产于北美洲，后被广泛引种到欧洲、亚洲等地。刺槐作为外来物种，在我国已经栽培了近120年，栽培范围多达27个省（市、自治区）[3]。目前国内关于刺槐生态特性、适应性、无性繁殖和有性生殖方面的研究较多[4-7]，但是遗传信息相对匮乏，需进一步开展刺槐无性系遗传多样性分析和遗传结构的研究，以期丰富刺槐遗传信息。
EST-SSR（expressed sequence tap SSR）标记不仅具有共显性遗传、多态性高、重复性好和技术简单的优点，还具有条带清晰、易于统计和开发较为廉价等优点[8-11]，而且由于EST-SSR来源于表达的基因组区域，可以直接反映相关基因的多样性，因此，在不同物种间也有良好的通用性[12-13]。目前松树（Pinus spp.）、杨树（Populus spp.）是利用EST-SSR进行研究最多的林木。云杉（Picea asperata）、白桦（Betula platyphylla）、火炬松（Pinus taeda）和茶树（Camellia sinensis）等树种中EST-SSR标记也得到了开发和应用[14-15]。而且，EST-SSR标记已广泛应用于花卉[16-17]、水果[18-19]、作物[20-21]的研究中。但是，目前罕有关于使用刺槐转录组数据开发的EST-SSR标记的相关报道，这极大地限制了刺槐种质资源的遗传变异、保存和分子育种研究。因此，急需系统开展刺槐无性系遗传多样性分析和遗传结构的研究，以便为品种选育、遗传改良和品种鉴定等工作奠定理论基础。赵克奇等[22]对刺槐EST-SSR标记PCR反应体系进行了优化，为后续对刺槐遗传多样性的研究提供了便利。Guo等[23]基于刺槐转录组数据，开发并筛选出了45对多态性较好的引物，为研究刺槐遗传多样性和种群结构奠定了理论基础。
本试验采用45对EST-SSR标记对山西省吉县刺槐国家良种基地收集的96个刺槐无性系进行遗传多样性和遗传结构的研究，拟阐明：（1）课题组所开发引物的多态性，为引物利用提供理论参考；（2）解析该基地收集的无性系种质的遗传多样性及亲缘关系，丰富刺槐遗传信息；（3）为该基地的资源管理和优良无性系的选育及改良奠定理论基础。
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吉县刺槐国家良种基地位于山西省临汾市，地处36°06′16″N、111°41′21″E，海拔1 000 ~ 1 200 m，属黄土残垣沟壑区，沟深陡而坡平缓，阳光充足，气候温和，年平均气温9 ℃左右，年降雨量520 mm，无霜期190 d左右。
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试验材料为来自山西吉县刺槐国家良种基地收集的刺槐优良无性系，共96份。于2016年4月，挑选枝条生长健壮，且叶片无病虫害的植株，采集幼嫩叶片，每株树取10 ~ 15片叶放于装有硅胶的自封袋中，带回试验室，置于干燥常温环境保存备用。其中，1 ~ 34号来源于全国，35 ~ 46号来源于北美，47 ~ 61号来源于临县紫金山林场，62 ~ 77号和80 ~ 87号来源于吉县国营红旗林场，78 ~ 79号来源于黎城县苗圃，88 ~ 90号来源于朔县萍家庄林场，91号来源于屯留县宜神岑林场，92 ~ 96号来源于太原市林场大沙荒。
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使用天根生物科技有限公司的植物基因组DNA试剂盒，分别提取96个刺槐无性系样品的总基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA质量和浓度，使用Nano-Drop 2000（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA）进一步定量检测总DNA的浓度和纯度。检测结果符合后续实验要求，将提取的DNA置于− 20 ℃冰箱保存备用。
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选取课题组开发[23]且经过验证为多态性较好的45对EST-SSR引物（表1）由睿博兴科生物公司合成，用双蒸水按照比列溶解，置于− 20 ℃保存备用。
表 1 试验所用EST-SSR引物信息
Table 1. Information of EST-SSR primers used in the experiment
位点 Locus 引物序列 Primer sequence (5′−3′) 重复基元 Repeat motif 大小 Size/bp 退火温度 Ta/℃ Rp-01 F: TGCAGAAAGAGAAAGCAGAGG （TGTGAA）4 140 58 R: CCGAACCCTTTCTGGTTAGTC Rp-02 F: GCTGCGTTTAATTTTGTCAGG （GAAT）4 170 58 R: TCAATCCATCAAAGAGGAAACA Rp-03 F: GTGAGAAGTGGTTAGGGTTTT （CTC）7 186 55 R: TCAAGATCACCAACGTACAA Rp-04 F: CTCGTGATGATGGTGTTGATG （AATGGT）4 146 58 R: AATGGTCCAAACAACACGAAG Rp-05 F: CCTTGCACATTTATCCCAGAA （TCTGGC）3 158 57 R: CGACCTCGATCTTTTCTTGTG Rp-06 F: TGGACAAAACATCATCGTGTG （TGAGTT）4 147 59 R: CTCTCTTCTTTCTGCCCCTCA Rp-07 F: TTTTTCTCCCAACGAAACAAA （CT）10 144 56 R: TGATGTGTTGTACGGAGGTGA Rp-08 F: TCAGGTGCATAAGCTCATTACTTC （AAAAT）4 152 56 R: GGTTGTCAGATGAAATGCACA Rp-09 F: CGTTTAGAAGCTGAGGCAGAA （CTTT）5 153 58 R: TGAGATATCTTAGTGCAGGAGCA Rp-10 F: GGCATGTGGCTATGAAGATGT （CCTTT）4 154 57 R: TCAGTGGGACTTGGTTTCTTG Rp-11 F: GAAGCTATCACCGCAAATGAA （AG）10 150 57 R: GTCGAAGTGCGTCCTAGATCA Rp-12 F: AAGAGTCATCACGGAGACCAA （AGCAGA）4 150 56 R: GGAGTCCAATTAAGTGCGAGA Rp-13 F: CATTTCCGATTTCCAATTCCT （CTCTTC）4 151 56 R: GCCGAGGACTCGGTAGAAGT Rp-14 F: TTAGCACGAACCTGGTTATGG （TGCAAC）4 151 56 R: CACTTCATTTGGTTCCTTGAGA Rp-15 F: TTAACTAATGCGGCGAGAAGA （TCAC）5 119 56 R: GAGAGGAAGTGTGCGAAACAA Rp-16 F: TATGAGACAGTGTTGGTTGGT （TTCAGT）4 175 56 R: CGTGCCAGAAGAGTATAACAG Rp-17 F: GTAAGTCTGCAAAGAAGACCA （AACCA）4 150 56 R: GCTTTTCACCTATCAACTCAA Rp-18 F: GGATGAACTTTGGCAATCCTT （GGTCAG）4 158 55 R: AATTTGTTGGGAATGCTGTTG Rp-19 F: CAGGAGTGGCAGCATTAGTGT （AGGCTG）4 123 56 R: CACAACAAGCACATTTTGCAC Rp-20 F: TTTCTTGGCTTGCTTTTGCTA （GCAGCT）3 145 56 R: TCTTGGATACGCAAGGTTGTC Rp-21 F: TATGATCACGTCCCCTAATGC （CCA）7 146 57 R: AAGTGGAAAGAAATGGGATGG Rp-22 F: GGTAAGGTGAAGGAGGTGGAG （AGGGTT）4 150 56 R: AGCTTGGTCTCCTAGGTCGTC Rp-23 F: GGAGGAGCAACCATCTGTGTA （AGAAGT）4 146 56 R: CTCCCTCTTCATCCTCACCTC Rp-24 F: TGCACATATTTGCCTGGTTTA （AATA）4 160 56 R: AAAATGAGCATGACACAACCA Rp-25 F: CGGCAACAAGTTGAGAAGAAC （AAAG）5 139 56 R: GGCTCACAAACCAACCTATGA Rp-26 F: GCTGCAAGCAAAGGATCTTAC （ATGATA）4 139 56 R: CCTCATCATCCTCGTCATCAT Rp-27 F: TGGACAAAACATCATCGTGTG （TGAGTT）4 147 57 R: CTCTCTTCTTTCTGCCCCTCA Rp-28 F: CTTGGTCTAGAAAGTCCTGCT （CAG）7 151 56 R: GGTCATCAAGGTTAGTTGGAT Rp-29 F: CCTGATGATCAAAACGACGAC （GATC）4 148 56 R: GGAGGTGACCCCTCTTATCCT Rp-30 F: TTGAACCAAAACTGGAAGAGC （GCT）8 151 56 R: GCACCGTACAGTTACCCTATCC Rp-31 F: GACCCCATTTTTCTCAAGGAC （ATT）7 140 56 R: TTGGATAAGTCGGTGAAGGTG Rp-32 F: CCACGTGGTTCTTCAAACATT （GTG）7 163 57 R: CAACAACAACCCACAAACACA Rp-33 F: CAAACAGTCTCATGGAAATGGA （ATC）7 141 56 R: GGGTTGGTATTGTTGGGAAAT Rp-34 F: AGGATATTAGCCAAGTCCATC （TGGTGA）4 164 57 R: AGTAACCATCACCACAATCAC Rp-35 F: TCAGACGTGGTAGAGCAGTGTT （CACAC）4 152 58 R: ATTTGTTTTTGGGGGAGATTG Rp-36 F: CGTTTCAGCCATTGATTTTGT （GAATC）5 141 57 R: GATCATCACCGTCCACCTTC Rp-37 F: TGTCGTCATTTTATTTTACCC （GAACGA）4 152 56 R: CTCACCCTTTTTATTTCCATT Rp-38 F: TCCATTCCCTGGTTTCTTCTT （TC）10 150 56 R: AGCACAATTTCCTCAGTGCAG Rp-39 F: TTAAAGAATGTTCCGTTCAGA （AAGAGG）3 152 56 R: GAGAAGATAGCCTCCTAGCTG Rp-40 F: TCATTGGACATCCCTCCATAA （TAA）8 139 56 R: GGCTCGACATGGTTGATTTT Rp-41 F: AACTCACCCAATTGCACACTC （CCA）7 143 56 R: GAGCAAGAGCTAAAGCAGCAA Rp-42 F: CTTCGCAATCCTCACTCTTTG （AATC）4 169 55 R: CTTACCCAGAAGCCAACAATG Rp-43 F: CAAAGCAGAGAGAATGTATGG （CAAAAT）4 155 57 R: ATCCCTTGCTCCTTGTAATAG Rp-44 F: TATCTGGGAGAATCGAGAGCA （ATCA）5 145 57 R: CCACCATGGTTGTCCTTCTAA Rp-45 F: GGGTTGAGGAAGAGAGGAGAA （TTC）7 156 57 R: AAAAATCGAATCGTGTTGGTG -
PCR扩增的反应体系如下：总体积20 μL，其中含有2 μL基因组DNA（20 ng/μL），10 μL 2 × TSINGKE®Master Mix（蓝色）（北京擎科生物科技有限公司），4 μL具有荧光染料（FAM，HEX，ROX，TAMER）的M13引物（1 μmol/L；5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′），0.8 μL（1 μmol/L）正向引物和3.2 μL（1 μmol/L）反向引物的荧光标记[24]。
PCR反应的程序和条件如下：采用Touchdown模式，在94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ~ 59 ℃退火30 s（选择最佳退火温度，如表1所示），72 ℃延伸1 s，重复28个循环（每个循环降低0.5 ℃）。然后在94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重复10个循环，最后在72 ℃延伸10 min终止反应。使用BIO-RAD T100 PCR仪完成上述步骤。
扩增产物用毛细管电泳仪进行检测，由睿博兴科生物科技有限公司完成。
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用Microsoft Office Excel 2007 对所得数据进行整理，使用GeneMarker2.2.0对毛细管检测的结果进行等位基因的读取及统计，使用Popgene 1.32版软件对群体遗传参数进行评估，包括观察的等位重复序列（Na）、有效等位重复序列（Ne）、Shannon信息指数（I）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）。多态性信息含量（PIC）使用PIC-CALC 0.6版本计算，然后利用NTsys 2.10e进行聚类分析。
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试验结果表明，除了引物RP-24，其余44对引物均表现出良好的多态性。因此，采用44对引物进行数据分析。由表2可以看出，44对引物共检测到等位重复序列298个，每对引物检测到2 ~ 15个，平均6.77个。共检测到有效等位重复序列104.9个，只占35.2%。无效等位重复序列的高发生率是导致杂合子缺失的原因之一[25]。Shannon信息多样性指数（I）的变化范围为0.203 8 ~ 2.018 3，平均为0.991 9。群体的观测杂合度（Ho）的变化范围为0.022 7 ~ 0.842 1，平均为0.412 6。期望杂合度（He）的变化范围为0.088 7 ~ 0.822 3，平均为0.484 0。平均观测杂合度小于平均期望杂合度，表明杂合子缺失。这与Guo等[26]利用35对SSR引物对不同种源的367份刺槐资源进行遗传多样性分析的研究结果相符。
表 2 44对引物扩增结果及多态性信息
Table 2. Amplification results and polymorphic information of 44 pairs of primers
引物 Primer 观测杂合度 Ho 期望杂合度 He Nei氏指数 Nei 等位重复序列 Na 有效等位重复序列 Ne Shannon信息指数 I 引物多态性信息量 PIC RP-01 0.623 7 0.629 4 0.626 0 6 2.674 0 1.152 8 0.557 1 RP-02 0.106 7 0.125 3 0.124 4 2 1.142 1 0.244 9 0.116 8 RP-03 0.641 3 0.628 1 0.624 6 11 2.664 1 1.329 8 0.571 7 RP-04 0.781 6 0.790 8 0.786 2 8 4.678 0 1.638 4 0.752 4 RP-05 0.540 2 0.673 0 0.669 2 15 3.022 8 1.680 0 0.652 5 RP-06 0.734 0 0.738 4 0.734 4 7 3.765 6 1.445 5 0.690 5 RP-07 0.842 1 0.816 8 0.811 5 11 5.303 9 1.892 0 0.788 2 RP-08 0.505 4 0.726 6 0.722 7 7 3.606 8 1.426 1 0.679 1 RP-09 0.648 9 0.660 8 0.657 3 15 2.918 1 1.529 9 0.615 7 RP-10 0.433 0.422 9 0.420 6 5 1.725 8 0.798 4 0.375 7 RP-11 0.719 1 0.822 3 0.817 7 14 5.485 5 2.018 3 0.796 6 RP-12 0.750 0 0.776 8 0.772 7 10 4.400 1 1.646 2 0.737 7 RP-13 0.315 8 0.362 2 0.360 3 9 1.563 2 0.878 1 0.350 0 RP-14 0.395 6 0.708 7 0.704 8 10 3.387 6 1.556 5 0.671 7 RP-15 0.416 7 0.371 6 0.369 6 8 1.586 4 0.802 4 0.345 2 RP-16 0.162 8 0.173 2 0.172 2 4 1.208 0 0.374 9 0.163 6 RP-17 0.250 0 0.247 7 0.246 4 7 1.327 0 0.572 3 0.236 1 RP-18 0.434 2 0.599 3 0.595 4 7 2.471 5 1.085 8 0.512 3 RP-19 0.446 8 0.610 6 0.607 4 7 2.547 1 1.118 6 0.528 9 RP-20 0.046 0 0.088 7 0.088 2 3 1.096 7 0.203 8 0.085 2 RP-21 0.246 8 0.280 6 0.278 8 6 1.386 6 0.624 5 0.266 4 RP-22 0.602 2 0.595 9 0.592 7 5 2.455 0 1.141 4 0.546 7 RP-23 0.341 2 0.502 1 0.499 1 6 1.996 4 0.957 2 0.446 5 RP-25 0.104 2 0.139 2 0.138 5 5 1.160 7 0.345 2 0.134 9 RP-26 0.212 8 0.214 0 0.212 8 6 1.270 4 0.472 0 0.201 0 RP-27 0.118 3 0.112 5 0.111 9 3 1.126 0 0.242 6 0.106 6 RP-28 0.651 7 0.719 5 0.715 4 7 3.514 2 1.436 0 0.671 6 RP-29 0.022 7 0.107 8 0.107 2 2 1.120 0 0.218 1 0.101 4 RP-30 0.268 8 0.416 6 0.414 3 5 1.707 4 0.775 8 0.367 3 RP-31 0.376 6 0.561 2 0.557 6 10 2.260 4 1.269 3 0.532 9 RP-32 0.511 9 0.635 9 0.632 1 7 2.718 0 1.246 2 0.578 3 RP-33 0.557 9 0.444 1 0.441 7 4 1.791 2 0.696 4 0.357 3 RP-34 0.500 0 0.523 5 0.520 6 8 2.086 0 1.106 7 0.485 3 RP-35 0.375 0 0.565 1 0.561 9 5 2.282 7 0.987 2 0.486 1 RP-36 0.512 2 0.661 5 0.657 4 4 2.919 0 1.167 6 0.590 9 RP-37 0.612 9 0.665 1 0.661 5 6 2.954 4 1.353 5 0.628 0 RP-38 0.556 8 0.774 9 0.770 5 15 4.357 9 1.895 0 0.741 3 RP-39 0.392 4 0.592 3 0.588 5 5 2.430 3 1.021 3 0.507 8 RP-40 0.178 9 0.182 0 0.181 0 3 1.221 0 0.345 7 0.166 4 RP-41 0.315 8 0.331 3 0.329 5 6 1.491 5 0.706 5 0.311 7 RP-42 0.281 7 0.459 5 0.456 3 2 1.839 1 0.648 7 0.352 2 RP-43 0.221 1 0.305 3 0.303 7 4 1.436 1 0.613 7 0.285 1 RP-44 0.081 4 0.133 3 0.132 6 4 1.152 8 0.317 1 0.129 0 RP-45 0.315 2 0.398 4 0.396 2 4 1.656 2 0.661 0 0.333 4 总计 Total 298 104.907 6 均值 Mean 0.412 6 0.484 0 0.481 2 6.772 7 2.384 3 0.991 9 0.444 4 引物多态性信息量（PIC）变化范围为0.085 2 ~ 0.796 6，平均为0.444 4。PIC值越高，表明物种遗传差异越大，遗传多样性越高，即遗传背景越复杂。根据Botstein等[27]的理论，本试验用的44个标记中，有10个标记为低度多态位点（0 < PIC < 0.25），13个标记为中度多态位点（0.25 < PIC < 0.5），21个标记为高度多态位点（PIC > 0.5），RP-11的PIC最高为0.796 6，以上结果表明试验所选的44对EST-SSR引物在96份刺槐资源中有良好的多态性。Nei氏指数在0.088 2 ~ 0.817 7之间，平均为0.481 2，表明96个种质资源之间遗传差异较大，遗传多样性较高，遗传基础较宽。
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由图1可知，在遗传距离为0.81时，可将96个无性系聚成5类，第Ⅰ类只包含1号无性系，第Ⅴ类只包含96号无性系，表明这两个无性系与其他系号遗传关系较远。第Ⅲ类包括9、15、17、19、28、34、35、73、78、84、53、72、21、32、22、47、49、65号共18个无性系，其中19与28号首先聚成一类，且均来自全国（即除山西以外的省）选优，说明这两个无性系亲缘关系较近，极有可能来自同一省。第Ⅳ类包括93和95号两个无性系，这两个无性系均来自太原市林场大沙荒。但是，与来自同一地区的92、94以及96号遗传距离较远。其余74份资源聚成第Ⅴ类，这一类包含的无性系最多，涉及的区域也较多。其中82与83号最先聚成一类，表明二者遗传关系最近；64与其余73个无性系遗传距离较远，最后聚在一起。
图 1 基于EST-SSR数据的96份刺槐资源聚类图
Figure 1. Dendrogram of 96 Robinia pseudoacacia resources based on EST-SSR data
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通过等位重复序列的数目，可以衡量遗传多样性[28]。毛秀红等[29]利用8对SSR引物对山东省5个不同栽培区的49份刺槐无性系进行了遗传多样性的研究，每个位点检测到等位重复序列2 ~ 15个，平均为6.375个。不同位点的PIC变化范围为0.092 ~ 0.879，平均为0.508 9。孙芳等[30]利用ISSR对全国10个刺槐居群子代100个个体的遗传多样性进行了分析，用10个多态性引物进行扩增，共检测到91个位点，多态位点百分率为93.41%。王东升等[31]利用AFLP分子标记技术对53个刺槐无性系进行了遗传多样性分析，8对引物共检测到多态性位点1 218条，占总谱带的99.02%。杨敏生等[32]对来自欧洲和美国的18个刺槐种源子代进行等位酶分析，平均等位基因变化范围在1.56 ~ 3.67之间，平均有效等位基因变化范围在1.02 ~ 2.50之间。本试验利用44对EST-SSR引物对山西省吉县刺槐国家良种基地收集的96份刺槐资源进行研究，每对引物检测到等位重复序列2 ~ 15个，平均6.77个。引物信息量多态性变化范围为0.085 2 ~ 0.796 6，平均为0.444 4。造成上述差异的原因可能为：采用的分子标记不同，所选择的引物不同，以及试验材料的不同。
不同的分子标记技术，均能直接反映出基因组DNA间的多态性差异[33]，根据具体情况，选择适宜的方法，有利于高效鉴定各刺槐群体的遗传多样性，为后续的研究提供理论依据。
EST-SSR标记来源于表达的基因组区域，可以直接反映相关基因的多样性，因此，更适用于种质资源遗传多样性评价[34]。本研究基于EST-SSR标记对山西吉县收集的96个刺槐无性系进行了分析，44对EST-SSR标记表现出良好的多态性。一方面说明本试验选用的山西吉县刺槐国家良种基地收集的刺槐资源具有较大的代表性，另一方面也说明EST-SSR在刺槐品种和种质资源上具有丰富的多态性。因此，开发更多EST-SSR标记，丰富刺槐遗传信息，应该成为刺槐资源后续研究的重要内容。而且，利用EST-SSR分子标记进行试验过程较为简单，易于操作，扩增谱带较为清晰，结果稳定，适于进行刺槐资源间遗传多样性的分析。
但是，根据聚类图可知，来自同一地区的刺槐并未完全聚类到一起，说明试验中涉及的刺槐无性系与地理位置并无显著规律。王东升等[31]采用AFLP分子标记技术对53个刺槐无性系进行了遗传多样性和亲缘关系的分析，发现来源相同的无性系并未严格聚类在一起，未形成明显的地理变异模式。毛秀红等[29]基于SSR对山东省49个刺槐无性系进行了遗传多样性分析及指纹图谱构建，试验结果显示山东省刺槐具有较高遗传多样性，无性系分组与现有栽培区并无明显规律。孙芳等[30]利用ISSR对全国10个刺槐居群子代100个个体的遗传多样性进行了分析，由聚类分析可知，亲缘关系与地理分布在一定程度上相关，但未形成明显地理变异模式。本试验与前人对刺槐地理变异的研究结果一致。造成这一结果的原因可能与刺槐的引种历史有较大的关联，刺槐为外来树种，在引种过程中，经过间接选择来自不同地区的种群间遗传距离渐近，来自同一地区不同种群间遗传关系渐远，经遗传检测，在聚类图中可以看出有些不同来源的无性系先聚为一类，再与相同来源的无性系聚为一类。再者，试验所选材料为该基地收集的优树，可能在人工选择过程中，存在一定程度的趋同，导致来源不同的无性系的遗传距离减小，先聚为一类。
遗传多样性包括了一个物种所有个体间遗传变异的总和，是种群生存和发展的前提。本文基于EST-SSR分子标记对山西省吉县刺槐国家良种基地收集的96个刺槐无性系进行了遗传多样性分析。结果表明，该基地收集的刺槐有着丰富的遗传多样性。本研究结果不仅为我国刺槐资源提供了更多遗传学信息，也为厘清该地区刺槐亲缘关系，指导优良无性系选育，及遗传多样性的保护提供理论基础。
致谢 感谢牛东升、刘佳平、王红生、谭红岩在采样过程中给予的帮助，感谢郭琪、董黎、孙宇涵在试验过程中给予的帮助。
EST-SSR analysis of genetic diversity of Robinia pseudoacacia clones in Jixian County, Shanxi Province of northern China
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摘要:
目的了解各对EST-SSR引物检出的等位简单序列重复片段数量，解析吉县良种基地刺槐无性系种质的多态性状况与种质间亲缘关系，为引物利用和刺槐种质遗传管理提供参考。 方法利用课题组开发的45对EST-SSR引物进行PCR扩增，使用毛细管电泳仪对产物进行检测，用Popgene 1.32版软件对群体遗传参数进行评估，利用NTsys 2.10e进行聚类分析。 结果45对EST-SSR引物中，除了引物RP-24均表现出良好的多态性。44对引物共检测到等位重复序列298个，每对引物检测到2 ~ 15个，平均6.77个。群体观测杂合度（Ho）的变化范围为0.022 7 ~ 0.842 1，平均为0.412 6。期望杂合度（He）的变化范围为0.088 7 ~ 0.822 3，平均为0.484 0。引物多态性信息量（PIC）变化范围为0.085 2 ~ 0.796 6，平均为0.444 4。 结论该基地的刺槐无性系种质具有较高的遗传多样性。由聚类结果可知，在遗传距离为0.81时，可将96份刺槐无性系种质聚成5类。聚类图在分子水平上显示了刺槐无性系种质间的亲缘关系，研究结果对于利用这些引物用于刺槐的种质评价、资源管理和辅助育种有积极的参考价值。 Abstract:Objective This paper aims to understand the number of alleles of simple sequence repeats detected by EST-SSR primers, and to analyze the polymorphisms of germplasm of Robinia pseudoacacia clones in Ji xian County of Shanxi Province,northern China and the genetic relationship between germplasms, and provide reference for primer utilization and genetic management of Robinia pseudoacacia germplasm. Method 45 pairs of EST-SSR primers developed by our laboratory were used for PCR amplification, and the products were detected by capillary electrophoresis, the genetic parameters of population were evaluated by Popgene 1.32 software, and cluster analysis was performed by NTsys 2.10e. Result Except for primer RP-24, 45 pairs of EST-SSR primers showed good polymorphism. A total of 298 allelic repeat sequences were detected in 44 pairs of primers, and 2 to 15 were detected in each pair, with an average of 6.77. The observed heterozygosity (Ho) of the population ranged from 0.022 7 to 0.842 1, with an average of 0.412 6. The expected heterozygosity (He) varies from 0.088 7 to 0.822 3, averaging 0.484 0. Primer polymorphism information (PIC) ranged from 0.085 2 to 0.796 6, with an average of 0.444 4. Conclusion Robinia pseudoacacia clonal germplasm in this base has high genetic diversity. It can be seen from the clustering results that 96 genetic clones of the hedgehog clones can be clustered into five classes when the genetic distance is 0.81. Cluster maps showed the genetic relationship among the clones of Robinia pseudoacacia at the molecular level, and the results of the study have positive reference value for the use of these primers for germplasm evaluation, resource management and assisted breeding of Robinia pseudoacacia. -
Key words:
- Robinia pseudoacacia /
- EST-SSR /
- genetic diversity /
- cluster analysis
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图 1 基于EST-SSR数据的96份刺槐资源聚类图
Figure 1. Dendrogram of 96 Robinia pseudoacacia resources based on EST-SSR data
表 1 试验所用EST-SSR引物信息
Table 1. Information of EST-SSR primers used in the experiment
位点 Locus 引物序列 Primer sequence (5′−3′) 重复基元 Repeat motif 大小 Size/bp 退火温度 Ta/℃ Rp-01 F: TGCAGAAAGAGAAAGCAGAGG （TGTGAA）4 140 58 R: CCGAACCCTTTCTGGTTAGTC Rp-02 F: GCTGCGTTTAATTTTGTCAGG （GAAT）4 170 58 R: TCAATCCATCAAAGAGGAAACA Rp-03 F: GTGAGAAGTGGTTAGGGTTTT （CTC）7 186 55 R: TCAAGATCACCAACGTACAA Rp-04 F: CTCGTGATGATGGTGTTGATG （AATGGT）4 146 58 R: AATGGTCCAAACAACACGAAG Rp-05 F: CCTTGCACATTTATCCCAGAA （TCTGGC）3 158 57 R: CGACCTCGATCTTTTCTTGTG Rp-06 F: TGGACAAAACATCATCGTGTG （TGAGTT）4 147 59 R: CTCTCTTCTTTCTGCCCCTCA Rp-07 F: TTTTTCTCCCAACGAAACAAA （CT）10 144 56 R: TGATGTGTTGTACGGAGGTGA Rp-08 F: TCAGGTGCATAAGCTCATTACTTC （AAAAT）4 152 56 R: GGTTGTCAGATGAAATGCACA Rp-09 F: CGTTTAGAAGCTGAGGCAGAA （CTTT）5 153 58 R: TGAGATATCTTAGTGCAGGAGCA Rp-10 F: GGCATGTGGCTATGAAGATGT （CCTTT）4 154 57 R: TCAGTGGGACTTGGTTTCTTG Rp-11 F: GAAGCTATCACCGCAAATGAA （AG）10 150 57 R: GTCGAAGTGCGTCCTAGATCA Rp-12 F: AAGAGTCATCACGGAGACCAA （AGCAGA）4 150 56 R: GGAGTCCAATTAAGTGCGAGA Rp-13 F: CATTTCCGATTTCCAATTCCT （CTCTTC）4 151 56 R: GCCGAGGACTCGGTAGAAGT Rp-14 F: TTAGCACGAACCTGGTTATGG （TGCAAC）4 151 56 R: CACTTCATTTGGTTCCTTGAGA Rp-15 F: TTAACTAATGCGGCGAGAAGA （TCAC）5 119 56 R: GAGAGGAAGTGTGCGAAACAA Rp-16 F: TATGAGACAGTGTTGGTTGGT （TTCAGT）4 175 56 R: CGTGCCAGAAGAGTATAACAG Rp-17 F: GTAAGTCTGCAAAGAAGACCA （AACCA）4 150 56 R: GCTTTTCACCTATCAACTCAA Rp-18 F: GGATGAACTTTGGCAATCCTT （GGTCAG）4 158 55 R: AATTTGTTGGGAATGCTGTTG Rp-19 F: CAGGAGTGGCAGCATTAGTGT （AGGCTG）4 123 56 R: CACAACAAGCACATTTTGCAC Rp-20 F: TTTCTTGGCTTGCTTTTGCTA （GCAGCT）3 145 56 R: TCTTGGATACGCAAGGTTGTC Rp-21 F: TATGATCACGTCCCCTAATGC （CCA）7 146 57 R: AAGTGGAAAGAAATGGGATGG Rp-22 F: GGTAAGGTGAAGGAGGTGGAG （AGGGTT）4 150 56 R: AGCTTGGTCTCCTAGGTCGTC Rp-23 F: GGAGGAGCAACCATCTGTGTA （AGAAGT）4 146 56 R: CTCCCTCTTCATCCTCACCTC Rp-24 F: TGCACATATTTGCCTGGTTTA （AATA）4 160 56 R: AAAATGAGCATGACACAACCA Rp-25 F: CGGCAACAAGTTGAGAAGAAC （AAAG）5 139 56 R: GGCTCACAAACCAACCTATGA Rp-26 F: GCTGCAAGCAAAGGATCTTAC （ATGATA）4 139 56 R: CCTCATCATCCTCGTCATCAT Rp-27 F: TGGACAAAACATCATCGTGTG （TGAGTT）4 147 57 R: CTCTCTTCTTTCTGCCCCTCA Rp-28 F: CTTGGTCTAGAAAGTCCTGCT （CAG）7 151 56 R: GGTCATCAAGGTTAGTTGGAT Rp-29 F: CCTGATGATCAAAACGACGAC （GATC）4 148 56 R: GGAGGTGACCCCTCTTATCCT Rp-30 F: TTGAACCAAAACTGGAAGAGC （GCT）8 151 56 R: GCACCGTACAGTTACCCTATCC Rp-31 F: GACCCCATTTTTCTCAAGGAC （ATT）7 140 56 R: TTGGATAAGTCGGTGAAGGTG Rp-32 F: CCACGTGGTTCTTCAAACATT （GTG）7 163 57 R: CAACAACAACCCACAAACACA Rp-33 F: CAAACAGTCTCATGGAAATGGA （ATC）7 141 56 R: GGGTTGGTATTGTTGGGAAAT Rp-34 F: AGGATATTAGCCAAGTCCATC （TGGTGA）4 164 57 R: AGTAACCATCACCACAATCAC Rp-35 F: TCAGACGTGGTAGAGCAGTGTT （CACAC）4 152 58 R: ATTTGTTTTTGGGGGAGATTG Rp-36 F: CGTTTCAGCCATTGATTTTGT （GAATC）5 141 57 R: GATCATCACCGTCCACCTTC Rp-37 F: TGTCGTCATTTTATTTTACCC （GAACGA）4 152 56 R: CTCACCCTTTTTATTTCCATT Rp-38 F: TCCATTCCCTGGTTTCTTCTT （TC）10 150 56 R: AGCACAATTTCCTCAGTGCAG Rp-39 F: TTAAAGAATGTTCCGTTCAGA （AAGAGG）3 152 56 R: GAGAAGATAGCCTCCTAGCTG Rp-40 F: TCATTGGACATCCCTCCATAA （TAA）8 139 56 R: GGCTCGACATGGTTGATTTT Rp-41 F: AACTCACCCAATTGCACACTC （CCA）7 143 56 R: GAGCAAGAGCTAAAGCAGCAA Rp-42 F: CTTCGCAATCCTCACTCTTTG （AATC）4 169 55 R: CTTACCCAGAAGCCAACAATG Rp-43 F: CAAAGCAGAGAGAATGTATGG （CAAAAT）4 155 57 R: ATCCCTTGCTCCTTGTAATAG Rp-44 F: TATCTGGGAGAATCGAGAGCA （ATCA）5 145 57 R: CCACCATGGTTGTCCTTCTAA Rp-45 F: GGGTTGAGGAAGAGAGGAGAA （TTC）7 156 57 R: AAAAATCGAATCGTGTTGGTG 
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表 2 44对引物扩增结果及多态性信息
Table 2. Amplification results and polymorphic information of 44 pairs of primers
引物 Primer 观测杂合度 Ho 期望杂合度 He Nei氏指数 Nei 等位重复序列 Na 有效等位重复序列 Ne Shannon信息指数 I 引物多态性信息量 PIC RP-01 0.623 7 0.629 4 0.626 0 6 2.674 0 1.152 8 0.557 1 RP-02 0.106 7 0.125 3 0.124 4 2 1.142 1 0.244 9 0.116 8 RP-03 0.641 3 0.628 1 0.624 6 11 2.664 1 1.329 8 0.571 7 RP-04 0.781 6 0.790 8 0.786 2 8 4.678 0 1.638 4 0.752 4 RP-05 0.540 2 0.673 0 0.669 2 15 3.022 8 1.680 0 0.652 5 RP-06 0.734 0 0.738 4 0.734 4 7 3.765 6 1.445 5 0.690 5 RP-07 0.842 1 0.816 8 0.811 5 11 5.303 9 1.892 0 0.788 2 RP-08 0.505 4 0.726 6 0.722 7 7 3.606 8 1.426 1 0.679 1 RP-09 0.648 9 0.660 8 0.657 3 15 2.918 1 1.529 9 0.615 7 RP-10 0.433 0.422 9 0.420 6 5 1.725 8 0.798 4 0.375 7 RP-11 0.719 1 0.822 3 0.817 7 14 5.485 5 2.018 3 0.796 6 RP-12 0.750 0 0.776 8 0.772 7 10 4.400 1 1.646 2 0.737 7 RP-13 0.315 8 0.362 2 0.360 3 9 1.563 2 0.878 1 0.350 0 RP-14 0.395 6 0.708 7 0.704 8 10 3.387 6 1.556 5 0.671 7 RP-15 0.416 7 0.371 6 0.369 6 8 1.586 4 0.802 4 0.345 2 RP-16 0.162 8 0.173 2 0.172 2 4 1.208 0 0.374 9 0.163 6 RP-17 0.250 0 0.247 7 0.246 4 7 1.327 0 0.572 3 0.236 1 RP-18 0.434 2 0.599 3 0.595 4 7 2.471 5 1.085 8 0.512 3 RP-19 0.446 8 0.610 6 0.607 4 7 2.547 1 1.118 6 0.528 9 RP-20 0.046 0 0.088 7 0.088 2 3 1.096 7 0.203 8 0.085 2 RP-21 0.246 8 0.280 6 0.278 8 6 1.386 6 0.624 5 0.266 4 RP-22 0.602 2 0.595 9 0.592 7 5 2.455 0 1.141 4 0.546 7 RP-23 0.341 2 0.502 1 0.499 1 6 1.996 4 0.957 2 0.446 5 RP-25 0.104 2 0.139 2 0.138 5 5 1.160 7 0.345 2 0.134 9 RP-26 0.212 8 0.214 0 0.212 8 6 1.270 4 0.472 0 0.201 0 RP-27 0.118 3 0.112 5 0.111 9 3 1.126 0 0.242 6 0.106 6 RP-28 0.651 7 0.719 5 0.715 4 7 3.514 2 1.436 0 0.671 6 RP-29 0.022 7 0.107 8 0.107 2 2 1.120 0 0.218 1 0.101 4 RP-30 0.268 8 0.416 6 0.414 3 5 1.707 4 0.775 8 0.367 3 RP-31 0.376 6 0.561 2 0.557 6 10 2.260 4 1.269 3 0.532 9 RP-32 0.511 9 0.635 9 0.632 1 7 2.718 0 1.246 2 0.578 3 RP-33 0.557 9 0.444 1 0.441 7 4 1.791 2 0.696 4 0.357 3 RP-34 0.500 0 0.523 5 0.520 6 8 2.086 0 1.106 7 0.485 3 RP-35 0.375 0 0.565 1 0.561 9 5 2.282 7 0.987 2 0.486 1 RP-36 0.512 2 0.661 5 0.657 4 4 2.919 0 1.167 6 0.590 9 RP-37 0.612 9 0.665 1 0.661 5 6 2.954 4 1.353 5 0.628 0 RP-38 0.556 8 0.774 9 0.770 5 15 4.357 9 1.895 0 0.741 3 RP-39 0.392 4 0.592 3 0.588 5 5 2.430 3 1.021 3 0.507 8 RP-40 0.178 9 0.182 0 0.181 0 3 1.221 0 0.345 7 0.166 4 RP-41 0.315 8 0.331 3 0.329 5 6 1.491 5 0.706 5 0.311 7 RP-42 0.281 7 0.459 5 0.456 3 2 1.839 1 0.648 7 0.352 2 RP-43 0.221 1 0.305 3 0.303 7 4 1.436 1 0.613 7 0.285 1 RP-44 0.081 4 0.133 3 0.132 6 4 1.152 8 0.317 1 0.129 0 RP-45 0.315 2 0.398 4 0.396 2 4 1.656 2 0.661 0 0.333 4 总计 Total 298 104.907 6 均值 Mean 0.412 6 0.484 0 0.481 2 6.772 7 2.384 3 0.991 9 0.444 4
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