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白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响

张勇 胡晓晴 李豆 刘雪梅

张勇, 胡晓晴, 李豆, 刘雪梅. 白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
引用本文: 张勇, 胡晓晴, 李豆, 刘雪梅. 白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
Zhang Yong, Hu Xiaoqing, Li Dou, Liu Xuemei. Cloning the promoter of BpSPL8 from Betula platyphylla and overexpression of BpSPL8 gene affecting drought tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
Citation: Zhang Yong, Hu Xiaoqing, Li Dou, Liu Xuemei. Cloning the promoter of BpSPL8 from Betula platyphylla and overexpression of BpSPL8 gene affecting drought tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137

白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项基金E类项目(2572015EA05)
详细信息
    作者简介:

    张勇。主要研究方向:植物基因工程。Email:202026713@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学生命科学学院126信箱

    通讯作者:

    刘雪梅,教授,博士生导师。主要研究方向:植物发育与分子调控。Email:695898040@qq.com 地址:同上

  • 中图分类号: S 718.43; S792.153; Q943.2

Cloning the promoter of BpSPL8 from Betula platyphylla and overexpression of BpSPL8 gene affecting drought tolerance in Arabidopsis thaliana

  • 摘要: 目的目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。方法通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS(β-葡萄糖苷酸酶编码基因)的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。结果启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29BP5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。结论异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29BP5CS1的表达模式。
  • 图  1  ProSPL8::GUS拟南芥的组织化学GUS测定

    a. 野生型拟南芥未检测到GUS活性;b. GUS活性在转ProSPL8::GUS拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序检测到;c. 转ProSPL8::GUS拟南芥叶片;d. 转ProSPL8::GUS拟南芥叶柄;e. 转ProSPL8::GUS拟南芥根;f. 转ProSPL8::GUS拟南芥花序。a, wild type Arabidopsis thaliana without GUS activity; b, GUS activity was observed in hypocotyls, leaves, petioles, roots and inflorescences of ProSPL8::GUS transgenic Arabidopsis thaliana; c, leaves of ProSPL8::GUS; d, petiole of ProSPL8::GUS; e, root of ProSPL8::GUS; f, inflorescence of ProSPL8::GUS.

    Figure  1.  Histochemical GUS staining of ProSPL8::GUS transgenic Arabidopsis thaliana

    图  2  10%PEG处理下BpSPL8基因在野生型白桦叶和根中的表达模式

    Figure  2.  Expression patterns of BpSPL8 gene in Betula platyphylla leaves and roots under 10% PEG treatments

    图  3  干旱处理条件下野生型和35S::BpSPL8转基因拟南芥的生长状态及存活率

    WT为野生型拟南芥,35S::BpSPL8为BpSPL8过表达拟南芥。a. 处理前和干旱2周后野生型和35S::BpSPL8转基因拟南芥的表型;b. 干旱胁迫2周复水3 d后和正常生长条件下野生型和35S::BpSPL8转基因拟南芥的存活率(*P < 0.05)。WT is wild-type Arabidopsis thaliana, 35S::BpSPL8 is BpSPL8 overexpressing Arabidopsis thaliana. a, phenotype of wild-type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana before treatment and 2 weeks after drought; b, survival rate of wild-type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana under normal growth conditions and re-watering 3 days after 2 weeks of drought treatment (*P < 0.05).

    Figure  3.  Growth status and survival rate of wild-type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana under drought stress

    图  4  正常生长和干旱7 d 35S::BpSPL8转基因和野生型拟南芥脯氨酸和丙二醛的含量测定

    WT为野生型拟南芥(**P < 0.01),35S::BpSPL8为BpSPL8过表达拟南芥。WT is wild-type Arabidopsis thaliana, 35S::BpSPL8 is BpSPL8 overexpressing Arabidopsis thaliana (**P < 0.01).

    Figure  4.  Contents of proline and malondialdehyde in wild type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana under normal growth conditions and 7 days of drought treatment

    图  5  干旱处理下野生型和35S::BpSPL8转基因拟南芥DR29BP5CS1表达模式分析

    WT为野生型拟南芥;35S::BpSPL8为BpSPL8过表达拟南芥。WT is wild-type Arabidopsis thaliana, 35S::BpSPL8 is BpSPL8 overexpressing Arabidopsis thaliana.

    Figure  5.  Expression pattern analysis of DR29B and P5CS1 in wild type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana under drought treatment

    表  1  BpSPL8启动子中的顺式作用元件及相关功能预测

    Table  1.   Cis-acting elements and predicted functions in the sequence of BpSPL8 promoter

    顺式元件 Cis-element数量 Number功能 Function功能分类 Function group
    MBS4MYB binding site involved in drought-inducibilityBinding site specific response element
    MRE1MYB binding site involved in light responsivenessBinding site specific response element
    circadian3Circadian controlCircadian
    Box-W11Fungal elicitor responsive elementElicitor specific responsive element
    ABRE1Abscisic acid responsivenessHormone responsive element
    TGA-element1Auxin-responsive elementHormone responsive element
    GARE-motif3Gibberellin-responsive elementHormone responsive element
    ERE1Ethylene-responsive elementHormone responsive element
    TCA-element1Salicylic acid responsivenessHormone responsive element
    AE-box2Light responseLight responsive element
    Box 43Light responseLight responsive element
    Box I3Light responsive elementLight responsive element
    CATT-motif4Light responsive elementLight responsive element
    GAG-motif1Light responsive elementLight responsive element
    GA-motif2Light responsive elementLight responsive element
    GT1-motif1Light responsive elementLight responsive element
    H-box1Light responsive elementLight responsive element
    Sp16Light responsive elementLight responsive element
    TCT-motif1Light responsive elementLight responsive element
    G-Box2Light responsivenessLight responsive element
    G-box3Light responsivenessLight responsive element
    ATGCAAAT motif1Associated to the TGAGTCA motifPlant tissue-specific element
    MSA-like1Cell cycle regulationPlant tissue-specific element
    GCN4_motif1Endosperm expressionPlant tissue-specific element
    Skn-1_motif3Endosperm expressionPlant tissue-specific element
    CAT-box1Meristem expressionPlant tissue-specific element
    AC-II1Negative regulation of phloem expressionPlant tissue-specific element
    as-2-box1Shoot-specific expression and light responsivenessPlant tissue-specific element
    ARE1Anaerobic response elementStress responsive element
    TC-rich repeats1Defense and stress responsivenessStress responsive element
    HSE2Heat stress responsivenessStress responsive element
    GCC box1Wounding and pathogen responsivenessStress responsive element
    W box1Wounding and pathogen responsivenessStress responsive element
    5UTR Py-rich stretch2Conferring high transcription levelsTranscription regulation element
    AAGAA-motif1Unknown
    Unnamed__12Unknown
    Unnamed__32Unknown
    Unnamed__47Unknown
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-13
  • 修回日期:  2019-04-18
  • 网络出版日期:  2019-06-19
  • 刊出日期:  2019-08-01

白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
    基金项目:  中央高校基本科研业务费专项基金E类项目(2572015EA05)
    作者简介:

    张勇。主要研究方向:植物基因工程。Email:202026713@qq.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学生命科学学院126信箱

    通讯作者: 刘雪梅,教授,博士生导师。主要研究方向:植物发育与分子调控。Email:695898040@qq.com 地址:同上
  • 中图分类号: S 718.43; S792.153; Q943.2

摘要: 目的目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。方法通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS(β-葡萄糖苷酸酶编码基因)的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。结果启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29BP5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。结论异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29BP5CS1的表达模式。

English Abstract

张勇, 胡晓晴, 李豆, 刘雪梅. 白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
引用本文: 张勇, 胡晓晴, 李豆, 刘雪梅. 白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
Zhang Yong, Hu Xiaoqing, Li Dou, Liu Xuemei. Cloning the promoter of BpSPL8 from Betula platyphylla and overexpression of BpSPL8 gene affecting drought tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
Citation: Zhang Yong, Hu Xiaoqing, Li Dou, Liu Xuemei. Cloning the promoter of BpSPL8 from Betula platyphylla and overexpression of BpSPL8 gene affecting drought tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 67-75. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190137
  • SPL是植物特有的普遍存在的一类转录因子,在植物的生长发育中起重要的作用。目前在拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中已经鉴定出17个含有SBP-box结构域的SPL基因[1]。其中有11个SPL基因(AtSPL2-6、AtSPL9-11、AtSPL13ab和AtSPL15)是miR156/157的靶标[2-5]AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5在3′-UTR区域含有miR156的互补序列,它们能够影响植物开花[1],促进营养生长期到生殖生长期的过渡[3,6]AtSPL2、AtSPL10和AtSPL11在调节叶和花的形态特征中起重要作用[7]AtSPL9和AtSPL15冗余地调控植物营养生长到生殖生长的相变和叶片起始速率[8]。6个SPL基因,包括AtSPL1、AtSPL7、AtSPL8、AtSPL12、AtSPL14和AtSPL16,没有miR156/157的靶位点。其中AtSPL7通过控制COPT6的表达在根和芽发育中发挥作用[9]AtSPL14调节植物对伏马毒素B1(fumonisin B1)的敏感性[10]AtSPL1和AtSPL12过表达可提高拟南芥在生殖生长时期的耐热性[11]AtSPL8在调节花粉囊发育、雄性育性、赤霉素生物合成和信号传导中起关键作用[12-14]。目前对SPL基因功能的研究主要集中于植物从营养生长到生殖生长的相变和花的发育。尽管已有研究表明MsSPL8基因参与苜蓿(Medicago sativa)对干旱和盐胁迫响应[15],但有关SPL基因响应植物抗逆胁迫的研究还相对较少,特别是针对SPL8基因参与调控白桦( Betula platyphylla )逆境反应的作用机理尚待深入研究。

    干旱是一个关键的压力因素,对植物的生长和作物的生产力产生负面影响[16]。在干旱胁迫下植物会产生一系列的应激反应来避免细胞受到伤害[17]。在植物遭受干旱胁迫时细胞中的活性氧(ROS)含量增加,ROS会导致细胞内的生物活性大分子起脂质过氧化反应生成脂质过氧化产物,如丙二醛等;而脯氨酸则能保护细胞内的酶等生物大分子避免其受到ROS的破坏。拟南芥DR29B是已报道的胁迫响应基因[18],通过响应脱落酸(ABA)信号在植物受到干旱胁迫后上调表达,增加拟南芥的耐旱性。P5CS1基因是参与拟南芥中脯氨酸合成的关键基因,大量研究发现,干旱等逆境胁迫可使植物体内的辅氨酸含量急剧增加,P5CS1表达量升高[19]

    启动子在基因转录调控中占有核心地位[20],通过分析启动子顺式作用元件有利于研究基因的调控机制及转录调控模式,进而应用于基因工程进行植物遗传改良。通过对基因启动子的简单分析,可以让我们更有针对性的去研究基因的功能。本研究以白桦为研究对象,克隆了白桦BpSPL8启动子,发现该启动子序列中含有多个参与胁迫响应的顺式作用元件。BpSPL8基因在干旱处理的野生型白桦中表达水平上调,暗示BpSPL8基因可能参与白桦对干旱胁迫的响应。因此我们以白桦BpSPL8过表达和野生型拟南芥为实验材料,通过分析干旱处理后的生理指标和抗旱基因(DR29BP5CS1)的表达模式,鉴定BpSPL8基因在植物响应干旱胁迫中的功能。

    • 用于实验的白桦组培苗、植物表达载体pBI121-GUS、大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105由本实验室保存,拟南芥野生型(Columbia-0)购于ABRC公司。Taq酶、PCR MasterMix和胶回收及质粒提取试剂盒购自天根生物公司,制性内切酶XmaⅠ与Hind Ⅲ由NEB北京分公司提供,克隆载体pEASY®-Blunt Cloning Vector购自北京全式金生物公司。

    • 在先前的研究中我们已获得白桦BpSPL8基因(Gene Bank登录号JQ354964)。结合白桦基因组数据库(http://birch.genomics.cn/page/species/index.jsp),选择白桦BpSPL8基因起始转录位点上游2 000 bp左右启动子片段,利用Premier 5软件设计特异性引物。pSPL8-F:AGCAACAAGCAAGCAAGA;pSPL8-R:CGAGTAACGGAGTCGTTTC。按照PCR高保真酶KOD-plus-Neo试剂盒(TOYOBO公司)的反应体系,以白桦基因组DNA为模板,采用PCR 3步法的程序,其中57 ℃退火30 s,68 ℃延伸1 min,35个循环,克隆BpSPL8启动子片段。纯化回收目的片段连入克隆载体并转入大肠杆菌中,经菌液PCR鉴定,阳性克隆送至哈尔滨擎科生物科技有限公司测序。

      依据已获得的白桦BpSPL8启动子序列,用Premier 5设计酶切引物。pSPL8-XmaⅠ -F:CGCCCGGGTTGCATGCCT;pSPL8-Hind Ⅲ-R:CGAAGCTTCAAGACTTAAGCATCGC。以克隆载体为模板,经PCR扩增获得带有酶切位点的BpSPL8启动子目的片段。启动子目的片段和表达载体经限制性内切酶XmaⅠ与Hind Ⅲ切割后,用T4连接酶连接,转入大肠杆菌内。重组质粒通过菌液PCR和测序鉴定后,转入农杆菌EHA105中。

      按照张一南等[21]描述的浸花法,将启动子表达载体转化拟南芥。待成熟收获种子,消毒后置于含有50 mg/L卡那霉素的固体MS培养基中培养。2周后选取抗性苗移至土壤中,提取叶片DNA,使用启动子特异性引物pSPL8-F/R进行PCR检测。收集转基因种子以备后续实验。

    • 根据测序结果,与白桦基因组数据库中BpSPL8启动子序列进行比对。确定序列无误后利用启动子在线分析软件PLACE和PlantCARE对启动子顺式作用元件进行对比分析。

    • 依据Jefferson等[22]描述的染色方法,取开花期的整株转基因和野生型拟南芥置于GUS染色液中,染色24 h后用75%酒精煮沸脱色,期间不断更换酒精直至绿色完全脱去。

    • 选择生长20 d的白桦组培苗,置于添加了10%PEG的WPM培养基中,分别取0、6、12、24、36、48、和72 h处理的白桦根和叶片提取RNA,利用东洋纺RNA反转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kit)反转录成cDNA后,使用BpSPL8基因定量特异性引物F:GCTGTCGGGCGAGGAAGA;R:TTGAAGGGTTGGGTGTAGGG和内参引物actin-F:CATCTCTGATCGGAATGGAAG;actin-R:AGATCCTTTCTGATATCCACG对BpSPL8表达量进行分析。定量PCR使用的反应体系及程序参见KOD SYBR qPCR Mix kit(TOYOBO,Japan)试剂盒描述。

    • BpSPL8过表达纯合转基因拟南芥为实验室前期获得[23],命名为35S::BpSPL8。长日照下,将35S::BpSPL8和野生型拟南芥种子同时种植于土壤中生长,对生长20 d长势相同的野生型和35S::BpSPL8拟南芥,进行干旱(停止浇水)2周处理,观察转基因和野生型植株表型,复水3 d后,统计存活率。

    • 选择生长20 d的土培35S::BpSPL8和野生型拟南芥,设置干旱组与对照组。干旱组即停止浇水的当天记为干旱0 d,此时正常浇水的对照组记为对照0 d。取7 d后干旱组和对照组35S::BpSPL8和野生型拟南芥叶片,参照Yu等[24]的方法测量脯氨酸和丙二醛的含量。

    • 选择生长20 d的土培35S::BpSPL8和野生型拟南芥,分别提取干旱处理0、7、14和复水3 d后的转基因和野生型叶片RNA,以拟南芥ACT2(F:TATCGCTGACCGTATGAG;R:CTGAGGGAAGCAAGAATG)为内参基因;使用DR29B(F:GGAGAGAGCAGAGAGGCTCA;R:CCGTTGACCACCGAGATAGT)和P5CS1(F:TACACAGGCCCTCCAAGTGA;R:CTTGATTTGTCGCCGAATGT)基因定量引物进行qRT-PCR分析。

    • 使用Excel进行数据处理和显著性分析,作图由Graphpad prism软件完成,所有实验至少3次生物学重复。

    • 以白桦DNA为模板,参照先前已获得的BpSPL8 cDNA序列和基因组数据库设计引物,获得约2 000 bp的启动子片段。利用启动子在线分析软件PLACE和PlantCARE对BpSPL8启动子顺式作用元件分析。结果显示(表1),该启动子除了具备正常启动子必须的核心启动元件(TATA-box、CAAT-motif)外,还含有组织特异的启动元件(ATGCAAAT motif、Skn-1_motif、as-2-box、AC-II等)、植物激素响应元件(ABRE、TGA-element、GARE-motif、ERE、TCA-element等)、光响应元件(GAG-motif、CATT-motif、Box I等)和胁迫响应顺式元件(MBS、HSE、GCC box、W box等),暗示BpSPL8基因可能在光响应、植物激素信号和非生物胁迫方面起作用。

      表 1  BpSPL8启动子中的顺式作用元件及相关功能预测

      Table 1.  Cis-acting elements and predicted functions in the sequence of BpSPL8 promoter

      顺式元件 Cis-element数量 Number功能 Function功能分类 Function group
      MBS4MYB binding site involved in drought-inducibilityBinding site specific response element
      MRE1MYB binding site involved in light responsivenessBinding site specific response element
      circadian3Circadian controlCircadian
      Box-W11Fungal elicitor responsive elementElicitor specific responsive element
      ABRE1Abscisic acid responsivenessHormone responsive element
      TGA-element1Auxin-responsive elementHormone responsive element
      GARE-motif3Gibberellin-responsive elementHormone responsive element
      ERE1Ethylene-responsive elementHormone responsive element
      TCA-element1Salicylic acid responsivenessHormone responsive element
      AE-box2Light responseLight responsive element
      Box 43Light responseLight responsive element
      Box I3Light responsive elementLight responsive element
      CATT-motif4Light responsive elementLight responsive element
      GAG-motif1Light responsive elementLight responsive element
      GA-motif2Light responsive elementLight responsive element
      GT1-motif1Light responsive elementLight responsive element
      H-box1Light responsive elementLight responsive element
      Sp16Light responsive elementLight responsive element
      TCT-motif1Light responsive elementLight responsive element
      G-Box2Light responsivenessLight responsive element
      G-box3Light responsivenessLight responsive element
      ATGCAAAT motif1Associated to the TGAGTCA motifPlant tissue-specific element
      MSA-like1Cell cycle regulationPlant tissue-specific element
      GCN4_motif1Endosperm expressionPlant tissue-specific element
      Skn-1_motif3Endosperm expressionPlant tissue-specific element
      CAT-box1Meristem expressionPlant tissue-specific element
      AC-II1Negative regulation of phloem expressionPlant tissue-specific element
      as-2-box1Shoot-specific expression and light responsivenessPlant tissue-specific element
      ARE1Anaerobic response elementStress responsive element
      TC-rich repeats1Defense and stress responsivenessStress responsive element
      HSE2Heat stress responsivenessStress responsive element
      GCC box1Wounding and pathogen responsivenessStress responsive element
      W box1Wounding and pathogen responsivenessStress responsive element
      5UTR Py-rich stretch2Conferring high transcription levelsTranscription regulation element
      AAGAA-motif1Unknown
      Unnamed__12Unknown
      Unnamed__32Unknown
      Unnamed__47Unknown
    • 采用酶切链接的方法构建启动子表达载体,然后转化农杆菌。通过农杆菌介导的浸花法将启动子表达载体转化拟南芥,收集转化后的种子经卡那霉素抗性筛选,获得了卡那霉素抗性植株,将抗性苗移至土壤中待成熟收获种子,并提取每个株系的DNA,经PCR检测,获得了BpSPL8启动子转基因植株,成功转化的拟南芥被命名为ProSPL8::GUS

    • 选择开花期的转ProSPL8::GUS拟南芥和野生型进行GUS染色,结果如图1所示。野生型拟南芥即阴性对照无任何GUS表达活性(图1a);转ProSPL8::GUS拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花中(图1b ~ 1f)均呈现不同程度的蓝色,而茎及茎生叶中并未检测到GUS活性。

      图  1  转ProSPL8::GUS拟南芥的组织化学GUS测定

      Figure 1.  Histochemical GUS staining of ProSPL8::GUS transgenic Arabidopsis thaliana

    • 我们利用实时定量PCR的方法检测了PEG处理下BpSPL8基因在根和叶中的表达模式。在PEG处理的0 ~ 72 h内,BpSPL8基因在根和叶片中均呈现先上调后下调的一致的表达趋势。在0 ~ 36 h内BpSPL8在根和叶片中的表达量不断增加,在36 h时达到最高,相比较于0 h上调了25 ~ 30倍;36 ~ 72 h内BpSPL8基因表达水平逐渐下调,甚至在72 h的根中已恢复到0 h的表达水平(图2)。这一结果表明BpSPL8参与对干旱胁迫的响应。

      图  2  10%PEG处理下BpSPL8基因在野生型白桦叶和根中的表达模式

      Figure 2.  Expression patterns of BpSPL8 gene in Betula platyphylla leaves and roots under 10% PEG treatments

    • 35S::BpSPL8转基因拟南芥并未出现提前抽薹或生殖生长受到抑制的表型,而是与野生型同时进入生殖生长期。将生长20 d的35S::BpSPL8和野生型拟南芥进行干旱处理。停止浇水14 d后发现35S::BpSPL8转基因拟南芥叶片干枯,萎蔫死亡,而野生型受干旱影响较小(图3a)。统计其存活率发现,正常生长的转基因和野生型拟南芥的存活率均为100%;而经干旱胁迫14 d至复水3 d后,35S::BpSPL8转基因拟南芥的存活率仅为35.0%,显著低于野生型(54.7%)(图3b),表明BpSPL8过表达降低拟南芥的耐旱性。

      图  3  干旱处理条件下野生型和35S::BpSPL8转基因拟南芥的生长状态及存活率

      Figure 3.  Growth status and survival rate of wild-type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana under drought stress

    • 植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。在正常生长的条件下,野生型和35S::BpSPL8转基因拟南芥中的辅氨酸含量并无明显差异。干旱胁迫7 d后,35S::BpSPL8和野生型拟南芥中的脯氨酸含量均升高了,但转基因拟南芥中的辅氨酸含量显著低于野生型(图4)。丙二醛的含量在一定程度上反应细胞的损伤程度,丙二醛含量越高细胞损伤越大。在干旱胁迫下,35S::BpSPL8转基因拟南芥中的丙二醛含量明显高于野生型(图4)。这一结果进一步表明了过表达BpSPL8可降低拟南芥的耐旱性。

      图  4  正常生长和干旱7 d 35S::BpSPL8转基因和野生型拟南芥脯氨酸和丙二醛的含量测定

      Figure 4.  Contents of proline and malondialdehyde in wild type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana under normal growth conditions and 7 days of drought treatment

      对干旱处理0、7、14 d和复水3 d后的35S::BpSPL8和野生型拟南芥中DR29BP5CS1基因的表达模式进行了检测。结果显示,DR29BP5CS1均在干旱胁迫后上调表达。但值得注意的是干旱7 d时转基因拟南芥中DR29BP5CS1的表达水平低于野生型,而干旱14 d时转基因拟南芥中DR29BP5CS1的表达水平却高于野生型(图5)。与野生型比,转基因拟南芥延缓了抗逆基因DR29BP5CS1的上调表达。

      图  5  干旱处理下野生型和35S::BpSPL8转基因拟南芥DR29BP5CS1表达模式分析

      Figure 5.  Expression pattern analysis of DR29B and P5CS1 in wild type and 35S::BpSPL8 transgenic Arabidopsis thaliana under drought treatment

    • 植物受到干旱胁迫时,根系首先感受到胁迫信号[25]。过表达AtSPL8使拟南芥主根生长受到抑制[13]AtSPL3、AtSPL9和AtSPL10通过抑制侧根原基的形成影响侧根数量[26-27]。刘闯[28]在对BpSPL8基因的表达模式进行分析时,发现BpSPL8在白桦的根中具有表达特异性。Liu等[23]发现,BpSPL8基因能够抑制拟南芥侧根发育,促进主根生长。本文对转ProSPL8::GUS拟南芥进行了GUS染色,发现BpSPL8启动子在拟南芥的根中具有表达特异性(图1),由此推测BpSPL8可能在白桦根的生长发育中起作用。启动子对基因时空表达的调控具有关键作用,可通过分析启动子上的顺式作用元件来预测该基因的功能。我们发现在BpSPL8启动子上含有生长素、赤霉素、乙烯、脱落酸和水杨酸响应元件。其中,生长素能协同或拮抗其他植物激素在植物根的发育中发挥主导作用[29]。干旱胁迫下,大豆(Glycin max)和水稻(Oryza sativa)的NAC转录因子能调节生长素响应相关基因的表达来调控根的发育[30-31]。细胞分裂素和脱落酸对侧根的形成起负调控作用[32],而水杨酸[33]和乙烯[34]等激素能够促进侧根的形成。干旱信号会诱导多种植物激素协同完成逆境下植物生长发育的调控[35-36],在拟南芥中脱落酸能协同生长素、细胞分裂素和乙烯,从激素的合成、运输和信号的响应等多方面来调控干旱胁迫下根的发育[37]

      考虑到BpSPL8启动子中含有多个与胁迫相关的顺式作用元件,我们使用10%PEG处理野生型白桦,发现BpSPL8基因在白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的趋势(图2),表明BpSPL8基因参与植物对干旱胁迫的响应。拟南芥干旱复水实验结果显示,过表达BpSPL8拟南芥的存活率显著低于野生型。在拟南芥中AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5过表达会导致生殖生长提前[1,3,6],植株呈现营养生长的衰老,可能会影响干旱实验结果。但Liu等[23]BpSPL8过表达拟南芥表型统计和我们的研究过程中并未出现提前开花或者抑止开花的表型,而是与野生型同时进入生殖生长期,本研究发现的过表达植株的耐旱性降低并不是因为衰老而导致。干旱处理存活率统计中,对照组的存活率达到100%也同样证实了这一点。因此我们认为是BpSPL8基因的过表达使拟南芥的耐旱性降低,暗示BpSPL8基因在植物响应干旱胁迫中起负调控的作用。此结果也与Gou等[15]在苜蓿中的报道一致。

      DR29BP5CS1是拟南芥中已报道了的两个抗逆基因,干旱胁迫时这两个基因的表达量升高,增强拟南芥的耐旱性,如在拟南芥中异源过表达大豆GmbZIP16增加拟南芥的耐旱性,DR29BP5CS1的表达量也随之显著提高[38]。本研究通过实时定量PCR检测了转基因和野生型拟南芥中DR29BP5CS1的表达水平。结果发现,在正常的生长条件下DR29BP5CS1基因维持在一个较低的表达水平,而经干旱处理后这两个基因的表达量都升高了。在野生型中,二者均在干旱7 d表达量最高,而在转基因拟南芥中却推迟至干旱14 d才具备最高的表达水平,表明转基因拟南芥通过延迟上调抗逆基因DR29BP5CS1的表达来响应干旱胁迫。所以我们推测白桦BpSPL8可能通过干扰拟南芥抗旱基因DR29BP5CS1在干旱胁迫下的表达来降低拟南芥的耐旱性。因此,白桦BpSPL8参与胁迫响应的分子机制及其在白桦中的生物学功能将是今后的研究目标。

参考文献 (38)

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