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转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响

尹玢 陆海

尹玢, 陆海. 转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
引用本文: 尹玢, 陆海. 转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
Yin Bin, Lu Hai. Effects of oxidative stress on growth and development of suspension cells of Populus tomentosa by transcriptome analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
Citation: Yin Bin, Lu Hai. Effects of oxidative stress on growth and development of suspension cells of Populus tomentosa by transcriptome analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157

转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
基金项目: 国家自然科学基金项目(31500161)
详细信息
    作者简介:

    尹玢,博士生。主要研究方向:树木分子生物学。Email:yb891110@sina.com 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    陆海,教授,博士生导师。主要研究方向:树木分子生物学。Email:luhai1974@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S718.43;S792.117;Q943.2

Effects of oxidative stress on growth and development of suspension cells of Populus tomentosa by transcriptome analysis

  • 摘要: 目的毛白杨是多年生木本植物,由于其固着的生长模式,毛白杨存在长期承受胁迫的可能性。氧化胁迫是常见的非生物胁迫方式,在多个物种中均有不同程度的研究,然而以毛白杨为材料在转录水平的研究目前鲜有报道。通过转录组数据探明活性氧平衡的打破对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响。方法本研究对毛白杨悬浮细胞系进行H2O2胁迫处理,通过激光共聚焦显微镜和转录组测序技术(RNA-Seq),观察、分析了线粒体的形态学和基因表达量的差异。结果通过对转录组数据的分析得到了806个显著差异基因(P < 0.001且 |log2ratio| > 1),其中449个差异基因下调,357个差异基因上调。这些差异基因涉及细胞分裂、细胞分裂素的激活、赤霉素调控以及磷酸化途径。通过线粒体特异性染料并使用激光共聚焦显微镜观察氧化胁迫条件下毛白杨线粒体的形态学,结果表明氧化胁迫下线粒体以蠕虫状为主。结论通过分析氧化胁迫条件下细胞转录组数据,在RNA水平揭示了氧化胁迫对植物细胞生长发育的影响,为植物的应激反应和生长发育研究提供了理论基础。
  • 图  1  差异表达基因火山图

    x轴为差异倍数。y轴为校正后的P值。红点表示显著差异基因中上调的基因,绿点表示显著差异基因中下调的基因,蓝点表示不显著差异的基因。x, fold change. y, P-adjusted value. Red dots indicate significantly up-regulated differentially expressed genes, green dots indicate significantly down-regulated differentially expressed genes. Blue dots indicate non-significantly differentially expressed genes.

    Figure  1.  Volcano map of differentially expressed genes

    图  2  显著差异基因GO功能分布

    Figure  2.  GO function enrichment of DEGs

    图  3  上调差异基因GO功能富集

    Figure  3.  GO function enrichment of up-regulation DEGs

    图  4  下调差异基因GO功能富集

    Figure  4.  GO function enrichment of down-regulation DEGs

    图  5  线粒体形态学

    A、B、C分别是野生型细胞在未处理条件下线粒体形态(WT)、野生型细胞在AsA处理条件(1 mmol/L,3 h)下线粒体形态(WTA)、野生型细胞在H2O2处理条件(10 mmol/L,3 h)下线粒体形态(WTH);D是基于200个不同细胞的形态学定量统计。A, mitochondrial morphology of wild type cells under untreated conditions (WT). B, mitochondrial morphology of wild type cells under AsA treatment (1 mmol/L, 3 h) (WTA). C, mitochondrial morphology of wild type cells under H2O2 treatment (10 mmol/L, 3 h) (WTH). D, quantitative statistics based on 200 cells.

    Figure  5.  Mitochondrial morphology

    表  1  转录组测序数据的清本情况

    Table  1.   Details of transcriptome data

    样品名称 Sample name     WT WTH
    原始序列数据 Raw reads 55 304 398 55 500 942
    过滤后数据 Clean reads 53 555 976 53 151 550
    转化数据 Clean bases (G) 8.03 7.97
    误码率 Error rate/% 0.02 0.02
    Q20/% 96.45 95.55
    Q30/% 91.46 89.70
    G和C数量占总碱基百分比 GC content/% 44.15 44.11
    FPKM Interval (0 ~ 1) 18 797 (45.16%) 18 519 (44.49%)
    FPKM Interval (1 ~ 3) 3 648 (8.76%) 3 559 (8.55%)
    FPKM Interval (3 ~ 15) 9 969 (23.95%) 10 037 (24.11%)
    FPKM Interval (15 ~ 60) 6 850 (16.46%) 7 118 (17.10%)
    FPKM Interval (> 60) 2 360 (5.67%) 2 391 (5.74%)
    注:WT. 野生型;WTH. 过氧化氢处理的野生型;Q20. 测序质量质控值大于20的碱基数所占比;Q30. 测序质量质控值大于30的碱基数所占比;FPKM Interval. 每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目,按照不同表达水平区间统计。Notes: WT, wild type; WTH, wild type treated with hydrogen peroxide; Q20, percentage of the bases with a quality value larger than 20; Q30, percentage of the bases with a quality value larger than 30; FPKM Interval,expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced.
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    表  2  部分表达差异基因的功能分析

    Table  2.   Functional analysis of differentially expressed genes

    基因ID Gene ID Log2X PP value 描述 Description
    POPTR_0007s01610 − 6.747 351 0.000 857 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0006s04680 − 2.620 479 0.000 660 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0001s31100 − 2.468 582 0.000 053 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0001s31140 − 2.256 589 0.000 003 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0016s01820 − 2.123 790 0.000 004 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0016s01610 − 1.896 713 0.000 034 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0015s05670 − 1.837 034 0.000 211 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0006s05450 − 1.828 310 0.000 210 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0016s01780 − 1.736 171 0.000 083 UDP-glucosyltransferase
    POPTR_0005s26040 − 3.920 826 0.000 001 Gibberellin regulated protein
    POPTR_0002s02410 − 3.852 437 0.000 001 Gibberellin regulated protein
    POPTR_0001s30500 − 2.510 387 0.000 080 Gibberellin regulated protein
    POPTR_0005s27030 − 2.205 589 0.000 019 1 Cytokinin riboside 5′-monophosphate phosphoribohydrolase
    POPTR_0001s06070 − 4.445 984 0.000 001 Metallo-dependent phosphatase
    POPTR_0003s02480 − 2.184 144 0.000 001 Metallo-dependent phosphatase
    POPTR_0012s14700 − 2.024 093 0.000 003 Trehalose-phosphatase
    POPTR_0019s10030 − 1.738 044 0.000 131 Protein phosphatase 2C
    POPTR_0008s05950 − 1.639 843 0.000 127 Protein phosphatase 2C
    POPTR_0010s20720 − 1.555 082 0.000 512 Protein phosphatase 2C
    POPTR_0003s02940 − 1.540 729 0.000 242 Pyridoxal phosphate phosphatase
    POPTR_0008s20130 − 1.479 330 0.000 421 Pyridoxal phosphate phosphatase
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    , 温秀凤3, 郭晓萍, 吴坚, 冯晓峰, 冯仲科, 王玉兵, 李凯, 王晓楠, 严晓素, 刘玉军, 王华芳, 尹伟伦, 于京民2, 谢磊, 高荣孚, 邹坤, 赵兵, 王冬梅, 陈卫平, 刘艳, 杨伟光, 李凤兰, 王玉春, 张庆, 林善枝, 陶凤杰, 丁霞, 王民中, 呼晓姝, 刘玉军, 李镇宇, 张兴杰, 孙建华, 沈应柏, 汪植, 马建海, 蒋平, 赵新丽, 付瑞海.  香花槐愈伤组织的诱导与细胞悬浮培养技术 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 26-30.
    [19] 李绍才, 陈文汇, 范丙友, 朱教君, 金小娟, 时尽书, 吕建雄, 翟明普, 胡晓丽, 李世东, 孙晓梅, 王玉杰, 高峻, 谭伟, 窦军霞, 肖生春, 李发东, 杨振德, 潘存德, 颜容, 南海龙, 张冰玉, 徐双民, 张宇清, 周春江, 康宏樟, 冯仲科, 谢益民, 张一平, 三乃, 孟平, 韩海荣, 李建章, 刘红霞, 田小青, 孙海龙, 张守攻, 刘俊昌, 师瑞峰, 骆秀琴, 王云琦, 朱清科, 宋献方, 胡诗宇, 苏晓华, 肖洪浪, 蔡怀, 岳良松, 王笑山, 吴斌, 陆海, 马钦彦, 李义良, 赵博光, 姜伟, 杨志荣, 张雁, 周文瑞, 蒋佳荔, 刘昌明, 齐实, 齐实, 赵双菊, 李智辉, 何磊, 张劲松, 蒲俊文, 张永安, 宋清海, 蒋湘宁, 赵有科, 伊力塔, 朱金兆, 姚山, 葛颂, 齐力旺, 张德荣, 张岩, 于静洁, 刘元, 褚建民, 石丽萍, 杨聪, 吕守芳, 吴庆利, 曲良建, 康峰峰, 马超德, 崔保山, 刘鑫宇, 王玉珠, 王建华, 朱林峰, 刘相超, 胡堃, 田颖川, 唐常源.  毛白杨4-香豆酸: 辅酶A连接酶可溶性原核表达及活性检测 . 北京林业大学学报, 2006, 28(2): 1-8.
    [20] 刁一伟, 石娟, 陈玮, 张建军, 张丽丽, 杜晓, 郭惠红, 赵博光, 李成茂, 胡建忠, 韩烈保, 武三安, 张厚江, 贾黎明, 刘晓丽, 莫秋云, 骆有庆, 姜笑梅, 李文彬, 王昌俊, 张峻萍, 梁波, 徐文铎, 马履一, 王安志, 李镇宇, 申世杰, 清水晃, 邢长山, 宋菲, 石碧, 曾凡勇, 崔英颖, 李海林, 殷亚方, 赵林果, 王小平, 沉昕, 李景锐, 苏德荣, 壁谷直记, 金昌杰, 韦艳葵, 延廣竜彦, 陈卫平2, 关德新, 韩瑞东, 胡青, 蒋艳灵, 徐梅, 苗毅, 徐君, 裴铁璠, 高述民, 严晓素, 王瀛坤, 赵永利, 蒋平, 周军, 蒋平, 李凤兰, .  不同受害油松对油松毛虫幼虫生长发育的影响 . 北京林业大学学报, 2005, 27(6): 83-88.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-22
  • 修回日期:  2019-05-28
  • 网络出版日期:  2019-07-01
  • 刊出日期:  2019-09-01

转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
    基金项目:  国家自然科学基金项目(31500161)
    作者简介:

    尹玢,博士生。主要研究方向:树木分子生物学。Email:yb891110@sina.com 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 陆海,教授,博士生导师。主要研究方向:树木分子生物学。Email:luhai1974@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S718.43;S792.117;Q943.2

摘要: 目的毛白杨是多年生木本植物,由于其固着的生长模式,毛白杨存在长期承受胁迫的可能性。氧化胁迫是常见的非生物胁迫方式,在多个物种中均有不同程度的研究,然而以毛白杨为材料在转录水平的研究目前鲜有报道。通过转录组数据探明活性氧平衡的打破对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响。方法本研究对毛白杨悬浮细胞系进行H2O2胁迫处理,通过激光共聚焦显微镜和转录组测序技术(RNA-Seq),观察、分析了线粒体的形态学和基因表达量的差异。结果通过对转录组数据的分析得到了806个显著差异基因(P < 0.001且 |log2ratio| > 1),其中449个差异基因下调,357个差异基因上调。这些差异基因涉及细胞分裂、细胞分裂素的激活、赤霉素调控以及磷酸化途径。通过线粒体特异性染料并使用激光共聚焦显微镜观察氧化胁迫条件下毛白杨线粒体的形态学,结果表明氧化胁迫下线粒体以蠕虫状为主。结论通过分析氧化胁迫条件下细胞转录组数据,在RNA水平揭示了氧化胁迫对植物细胞生长发育的影响,为植物的应激反应和生长发育研究提供了理论基础。

English Abstract

尹玢, 陆海. 转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
引用本文: 尹玢, 陆海. 转录组分析氧化胁迫对毛白杨悬浮细胞生长发育的影响[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
Yin Bin, Lu Hai. Effects of oxidative stress on growth and development of suspension cells of Populus tomentosa by transcriptome analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
Citation: Yin Bin, Lu Hai. Effects of oxidative stress on growth and development of suspension cells of Populus tomentosa by transcriptome analysis[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(9): 90-98. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190157
  • 活性氧(ROS)是由于氧分子成为电子受体被还原而产生的,这一现象在细胞的生命周期中不可避免。活性氧包括超氧化物阴离子自由基、羟基自由基和过氧化氢等。活性氧产生于不同亚细胞结构中,可以产生严重的氧化伤害。然而,植物细胞也有一系列抗氧化机制能够清除过量的活性氧,从而避免细胞的生物分子遭受影响[1]。近年来,很多研究重新评估了活性氧的作用,“氧化胁迫”逐渐被引申为“氧化信号”[2-5]。这意味着活性氧除了是一个有害物质以外也是植物细胞信号网络的重要组成部分,植物利用这个信号网络完成生长发育和应对环境的改变[1-3]。因此,活性氧的含量在植物细胞中需要保持平衡,过多的活性氧产生氧化伤害,过少的活性氧则使信号通路受到影响。

    正常情况下,植物细胞内的活性氧水平是被一个庞大的抗氧化系统精确调控的。例如,在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有至少152个基因控制细胞内的抗氧化机制。这些基因被认为调控了不同亚细胞结构的活性氧产生和清除的速率,进而维持细胞的氧化防御和信号传递能力[6]。然而生物胁迫和非生物胁迫的介入能够引起植物细胞内活性氧水平的爆发,植物的生长发育也会因此受到影响。例如:病虫害、紫外线、金属离子、化学物质、环境毒素、高温和低温等[7-9]。与动物趋利避害的本能不同,固着生长模式的植物在面临胁迫时则采取防御适应的方式。其中,多年生的木本植物存在长期承受生物或非生物胁迫的可能性,因此搞清楚胁迫造成的活性氧水平紊乱对植物生长发育的影响是十分必要的。目前,很多研究都已证明活性氧平衡对维持细胞活性和保障生长发育异常重要[10-14],但是,以毛白杨为对象,在基因的表达调控水平却并没有进一步的解释。

    近年来,随着转录组测序技术(RNA-Seq)的不断完善,在转录水平揭示基因的表达调控趋势已经成为可能。植物悬浮细胞系具有生长快速、易获取、重复性好等优势,被广泛应用于细胞生物学、生物化学、生理学检测以及分子生物学等研究。而对于RNA-Seq来说,由于实验所需的植物样品较多,悬浮细胞无疑是良好的实验材料。本研究以毛白杨悬浮细胞为材料,在H2O2处理的条件下,通过RNA-Seq分析并解释了氧化胁迫对植物细胞生长发育的影响。同时,通过激光共聚焦显微镜观察了两种处理条件下线粒体的形态差异并进行了定量统计,为深入研究氧化胁迫对植物生长发育的影响奠定了理论基础。

    • 实验所用野生型毛白杨无菌幼苗来自本实验室保存。转录组测序所使用的毛白杨悬浮细胞由无菌幼苗叶片的愈伤组织诱导而来。MS培养基添加1.0 mg/L和6-苄基腺嘌呤(6-BA),0.1 mg/L萘乙酸(NAA)。

    • 取本实验室保存的毛白杨无菌幼苗的叶片,切成小块并接种于MS + 1.0 mg/L 2,4-D + 5 g/L琼脂 + 30 g/L蔗糖的固体培养基上诱导愈伤组织。培养25 d后,发育良好的淡黄色愈伤组织作为悬浮细胞系建立的初始材料。

    • 取生长旺盛的愈伤组织接种在液体MS培养基中,24 h避光振荡培养。悬浮培养初期的液体培养基为MS + 1.5 mg/L 2,4-D + 30 g/L蔗糖,14 d继代1次。在继代过程中,先将悬浮培养的细胞静置0.5 h,随后轻轻摇动致使部分细胞重悬,吸取重悬的优质细胞至新鲜液体培养基继续培养。培养初期的细胞在3次继代后成为稳定的悬浮细胞系,此后7 d继1次,培养基为MS + 0.8 mg/L 2,4-D + 30 g/L蔗糖。

    • 储备液浓度10 mol/L的H2O2直接向毛白杨悬浮细胞系中滴加,至终浓度10 mmol/L避光振荡培养3 h,室温,140 r/min。

      储备液浓度为100 mmol/L的AsA向毛白杨悬浮细胞系中滴加,终浓度为1 mmol/L,避光震荡培养3 h,室温,140 r/min。

    • 将野生型毛白杨悬浮细胞作为对照组,H2O2处理的野生型毛白杨悬浮细胞作为实验组样品进行后续的转录组分析。我们将样品和对照组通过液氮速冻10 min后交由诺禾致源进行文库制备、转录组测序和数据质检的分析。(1)文库制备和质检:总RNA提取后通过Nanodrop检测纯度,并使用Qubit对浓度进行定量。总RNA检测合格后,通过Oligo(dT)进行PCR富集并获得cDNA文库。随后使用Qubit进行文库定量,使用Aglient 2100检测文库质量是否合格。(2)转录组测序:测序平台是Illumina Genome Analyzer(HiSeqTM 2000;Illumina,San Diego,CA);原始数据(raw data)经过初步筛选后获得高质量的过滤后数据(clean data),并与毛果杨(Populus trichocarpa)的参考基因组进行匹配,使用软件为SOAPaligner;基因的表达水平通过定位到基因组区域或基因外显子区的测序序列的计数来计算,即每一百万个片段中来自某一基因每1 000 bp长度的片段数量(FPKM)[15]。相关转录组测序数据已经上传NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE110273),登录号码(accession number )GSE110273。

    • 野生型(WT)和H2O2处理的野生型(WTH)中基因的表达水平确定后,通过WTH vs. WT的比较,分析H2O2处理所带来的差异基因的变化,筛选标准为校正 P值 < 0.001 且 |log2ratio| > 1。

    • 对已筛选的差异基因进行GO功能富集分析,筛选标准为P < 0.005。

    • 激光共聚焦显微镜的使用型号为Leica TCS-SP8,线粒体荧光染料为MitoTracker Red CMXRos(Invitrogen),线粒体荧光信号的激发波长为578 nm,吸收峰在580 ~ 620 nm。所有样品通过409油浸镜倒置观察。线粒体的形态学定量统计基于200个不同细胞。

    • 将待染的毛白杨悬浮细胞孵育在含有终浓度0.3 μmol/L染料的缓冲液(0.3 mmol/L蔗糖、5 mmol/L TES、5 mmol/L MgCl2)中,室温避光孵育30 min[16]。静置2 min后弃上清并加入无染料的缓冲液,重悬细胞2 min,重复3次以完成背景清洗。

    • 转录组测序原始数据的基本情况见表1,评估合格可用。本研究采用表达差异倍数和统计学的方法进行结果筛选,筛选对象为以野生型毛白杨悬浮细胞(WT)为对照组,经过H2O2处理(WTH)的野生型毛白杨悬浮细胞为实验组,与WT比较的结果(WTH vs. WT)。筛选标准为校正P值 < 0.001 且 |log2ratio| > 1。如图1所示,相比于WT,WTH共有806个显著差异基因,其中449个基因下调,357个基因上调(图1)。

      图  1  差异表达基因火山图

      Figure 1.  Volcano map of differentially expressed genes

      表 1  转录组测序数据的清本情况

      Table 1.  Details of transcriptome data

      样品名称 Sample name     WT WTH
      原始序列数据 Raw reads 55 304 398 55 500 942
      过滤后数据 Clean reads 53 555 976 53 151 550
      转化数据 Clean bases (G) 8.03 7.97
      误码率 Error rate/% 0.02 0.02
      Q20/% 96.45 95.55
      Q30/% 91.46 89.70
      G和C数量占总碱基百分比 GC content/% 44.15 44.11
      FPKM Interval (0 ~ 1) 18 797 (45.16%) 18 519 (44.49%)
      FPKM Interval (1 ~ 3) 3 648 (8.76%) 3 559 (8.55%)
      FPKM Interval (3 ~ 15) 9 969 (23.95%) 10 037 (24.11%)
      FPKM Interval (15 ~ 60) 6 850 (16.46%) 7 118 (17.10%)
      FPKM Interval (> 60) 2 360 (5.67%) 2 391 (5.74%)
      注:WT. 野生型;WTH. 过氧化氢处理的野生型;Q20. 测序质量质控值大于20的碱基数所占比;Q30. 测序质量质控值大于30的碱基数所占比;FPKM Interval. 每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目,按照不同表达水平区间统计。Notes: WT, wild type; WTH, wild type treated with hydrogen peroxide; Q20, percentage of the bases with a quality value larger than 20; Q30, percentage of the bases with a quality value larger than 30; FPKM Interval,expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced.
    • 在显著差异基因的基础上,本研究根据对这些差异基因进行了GO功能分类分析。GO功能富集词条总计180个(P < 0.005),其中生物学过程(biological process)占总数的62%,细胞组成部分(cellular component)占总数的17%,分子功能(molecular function)占总数的21%(图2)。

      图  2  显著差异基因GO功能分布

      Figure 2.  GO function enrichment of DEGs

      为了对GO富集结果进行深入分析,本研究还分别分析了上调和下调基因的GO功能富集。上调基因的GO富集词条共计140个(P < 0.005),显著性富集结果中以生物学途径分类主要包括转移酶活性(18个基因)、蛋白质修饰(8个基因)、泛素蛋白连接酶活性(5个基因)、细胞周期调控(9个基因)、细胞壁大分子代谢过程(11个基因)等。以细胞组成部分分类包括光系统(9个基因)、细胞骨架蛋白(46个基因)、膜结构(11个基因)等。以分子功能分类包括糖基水解酶活性(43个基因)、泛素蛋白转移酶活性(18个基因)等(图3)。

      图  3  上调差异基因GO功能富集

      Figure 3.  GO function enrichment of up-regulation DEGs

      下调基因的GO富集词条共计40个(P < 0.005),显著性富集结果中以生物学途径分类主要包括肽酶活性调控(20个基因)、木葡聚糖代谢过程(5个基因)、水解酶活性调控(5个基因)、氧化还原过程(44个基因)等;以细胞组成部分分类包括质外体(27个基因)、质膜(12个基因)、细胞壁(11个基因)等;以分子功能分类包括木葡聚糖转移酶活性(6个基因)、天冬氨酸类肽链内切酶活性(18个基因)、氧化还原酶活性(46个基因)等(图4)。

      图  4  下调差异基因GO功能富集

      Figure 4.  GO function enrichment of down-regulation DEGs

    • 为了研究H2O2处理对毛白杨悬浮细胞基因表达水平的影响,本研究分析了野生型(WT)和H2O2处理的野生型(WTH)悬浮细胞其基因表达的水平,结果如图1所示。

      研究表明,UDP-葡萄糖基转移酶与有丝分裂有关并强烈地诱导细胞分裂[17]。在我们的结果中,下调的差异基因有一系列UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases;POPTR_0007s01610,POPTR_0006s04680,POPTR_0001s31100,POPTR_0001s31140,POPTR_0016s01820,POPTR_0016s01610,POPTR_0015s05670,POPTR_0006s05450,POPTR_0016s01780)(表2),因此H2O2处理抑制了这些基因的表达。植物生长激素赤霉素(Gibberellin)在非生物应激响应中处于核心地位,赤霉素水平的降低和信号传导被证明有助于限制植物在多种胁迫下的生长[18]。在本研究中,赤霉素相关基因显著下调(POPTR_0005s26040,POPTR_0002s02410,POPTR_0001s30500)(表2),这与以往的研究是一致的。此外有研究表明,细胞分裂素核苷5′-磷酸磷酸核糖水解酶(Cytokinin riboside 5′-monophosphate phosphoribohydrolase)直接参与了细胞分裂素的激活,这个基因的表达量受到干扰时细胞分裂素的稳态发生改变[19]。在我们的研究结果中,毛白杨细胞分裂素核苷5′-磷酸磷酸核糖水解酶(POPTR_0005s27030)显著下调,这表明外源H2O2的胁迫使细胞内细胞分裂素稳态发生改变(表2)。

      表 2  部分表达差异基因的功能分析

      Table 2.  Functional analysis of differentially expressed genes

      基因ID Gene ID Log2X PP value 描述 Description
      POPTR_0007s01610 − 6.747 351 0.000 857 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0006s04680 − 2.620 479 0.000 660 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0001s31100 − 2.468 582 0.000 053 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0001s31140 − 2.256 589 0.000 003 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0016s01820 − 2.123 790 0.000 004 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0016s01610 − 1.896 713 0.000 034 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0015s05670 − 1.837 034 0.000 211 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0006s05450 − 1.828 310 0.000 210 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0016s01780 − 1.736 171 0.000 083 UDP-glucosyltransferase
      POPTR_0005s26040 − 3.920 826 0.000 001 Gibberellin regulated protein
      POPTR_0002s02410 − 3.852 437 0.000 001 Gibberellin regulated protein
      POPTR_0001s30500 − 2.510 387 0.000 080 Gibberellin regulated protein
      POPTR_0005s27030 − 2.205 589 0.000 019 1 Cytokinin riboside 5′-monophosphate phosphoribohydrolase
      POPTR_0001s06070 − 4.445 984 0.000 001 Metallo-dependent phosphatase
      POPTR_0003s02480 − 2.184 144 0.000 001 Metallo-dependent phosphatase
      POPTR_0012s14700 − 2.024 093 0.000 003 Trehalose-phosphatase
      POPTR_0019s10030 − 1.738 044 0.000 131 Protein phosphatase 2C
      POPTR_0008s05950 − 1.639 843 0.000 127 Protein phosphatase 2C
      POPTR_0010s20720 − 1.555 082 0.000 512 Protein phosphatase 2C
      POPTR_0003s02940 − 1.540 729 0.000 242 Pyridoxal phosphate phosphatase
      POPTR_0008s20130 − 1.479 330 0.000 421 Pyridoxal phosphate phosphatase

      由于氧化胁迫能够不同程度的诱导细胞程序化死亡(PCD),而线粒体是PCD的关键控制点[20],因此我们在转录组数据中对线粒体相关功能进行了表达量的分析。我们的结果表明,大量与磷酸酶有关的基因显著下调(POPTR_0001s06070,POPTR_0003s02480,POPTR_0012s14700,POPTR_0019s10030,POPTR_0008s05950,POPTR_0010s20720,POPTR_0003s02940,POPTR_0008s20130),这表明线粒体的功能受到外源H2O2的影响而显著下降(表2)。

      总的来说,氧化胁迫对植物生长发育产生影响,是由于线粒体功能、细胞分裂、赤霉素含量以及细胞分裂素含量受到影响而产生的。

    • 由于转录组数据中与细胞分裂、线粒体功能有关的基因显著下调,这意味着线粒体的功能因此受到损伤进而影响了细胞的PCD程度,而线粒体形态学与其功能有密切联系[21],因此本研究通过激光共聚焦显微镜(CLSM)对线粒体的形态学进行了观察,以期进一步验证我们的观点。

      线粒体基于功能的好坏区分为4种形态:点状(Punctiform)、蠕虫状(Vermiform)、巨大型(Giant)、扩散型(Diffuse)[22]。而这4种线粒体形态可以通过线粒体特异性荧光染料MitoTracker Red CMXRos在激光共聚焦显微镜下被观察到。点状线粒体呈现点状或棒状并均匀分布在细胞质中;蠕虫状线粒体通常呈现明显的伸长,同时形成聚集体;巨大型线粒体相比于点状线粒体其体积明显增大,聚集成簇;扩散型线粒体的膜系统在此基础上进一步弥散,有彻底分解的趋势[21]。全部4种线粒体在WT和WTH中均有所观察和记录,结果表明,在WT中,点状、蠕虫状、巨大型和扩散型线粒体分别占85%、11%、2%、2%;而WTH中则是9%、74%、2%、15%(图5)。这表明正常情况下WT以点状线粒体为主,而外源H2O2处理后点状线粒体显著减少,取而代之的是蠕虫状和扩散型线粒体。这进一步说明了氧化胁迫对线粒体功能造成了损伤。除此之外,本研究还添加外源AsA稀释细胞内的H2O2水平,结果表明,WT经过AsA处理后(WTA)点状线粒体相比WT出现频率更高,这表明H2O2水平与线粒体结构和功能有密切联系(图5)。

      图  5  线粒体形态学

      Figure 5.  Mitochondrial morphology

    • 氧化胁迫是自然界极其普遍的非生物胁迫,虽然造成氧化胁迫的方式有很多种,但本质是要产生活性氧并开始一系列氧化还原反应,最终对植物细胞造成氧化损伤的。高等植物应对氧化胁迫主要依赖其复杂的活性氧调控系统抵消伤害,然而在这过程中过量的活性氧依然会产生一定程度的氧化损伤并影响植物的生长发育。

      本研究的结果表明,H2O2处理后的毛白杨悬浮细胞(WTH)相比于正常生长的毛白杨悬浮细胞(WT)在转录水平发生了显著差异,大部分差异基因与线粒体功能有关。同时,我们还通过激光共聚焦显微镜观察了毛白杨细胞的线粒体在H2O2处理前后的形态学变化,进一步佐证了氧化胁迫条件下线粒体功能的缺失。线粒体是植物细胞内非常重要的细胞器,是能量代谢的中心。尽管高等植物存在叶绿体也可以提供能量,但是木本植物还有很多非光合作用组织并依赖线粒体提供ATP。另外,线粒体除了氧化磷酸化途径外还是细胞程序化死亡(PCD)的关键控制点,在细胞PCD开始前,线粒体率先接受PCD信号并释放细胞色素C等细胞凋亡因子。多个研究表明,氧化胁迫对于多种植物都会产生氧化伤害进而影响生长发育过程[23-27]。这与我们的结果是一致的,本研究在转录水平揭示了氧化胁迫抑制磷酸酶活性并导致线粒体功能发生异常。因为呼吸链由多个呼吸复合物构成,在这之中,呼吸复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是质子泵并决定着线粒体膜内外的电位差[28]。磷酸酶活性的异常会导致电子传递链功能缺失,进而影响线粒体的膜电位差,使得线粒体的膜通透性改变、功能逐渐丧失,进而影响了细胞的PCD和生长发育过程。

      有丝分裂是真核细胞主要增殖的方式,也是维持个体正常生长发育、保证物种连续性和稳定性的关键。本研究中,外源H2O2处理导致有丝分裂相关基因显著下调,这很可能诱发有丝分裂过程的异常进而导致生长迟缓、细胞老化等现象。

      激素是植物生长发育过程中必不可少的控制者,例如生长素参与细胞壁的形成和核酸代谢,进而促进植物生长;以及细胞分裂素参与细胞有丝分裂,诱导芽的形成和生长。根据我们的结果,细胞分裂素的上游激活基因细胞分裂素核苷5′-磷酸核糖水解酶(Cytokinin riboside 5′-monophosphate phosphoribohydrolase)显著下调,这表明在激素水平的细胞分裂调控同样受到外源H2O2的抑制,进而影响了生长发育过程。根据最近的研究,赤霉素类的植物激素不但通过控制细胞伸长来调节植物生长发育,而且在非生物应激反应中起核心作用。本研究中,氧化胁迫导致赤霉素基因显著下调,这表明赤霉素对非生物胁迫的应激仍属于轻度激素调节范畴,其作用不足以抵消过量的氧化伤害,进一步证实了植物细胞的活性氧清除仍需要其复杂的抗氧化系统作为支撑。而激素调节仍旧以控制植物生长发育为主,面对非生物胁迫时的作用不够显著。

参考文献 (28)

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