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基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定

洪文娟 郝兆祥 刘康佳 罗华 毕润霞 苑兆和 宗世祥 王君

洪文娟, 郝兆祥, 刘康佳, 罗华, 毕润霞, 苑兆和, 宗世祥, 王君. 基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
引用本文: 洪文娟, 郝兆祥, 刘康佳, 罗华, 毕润霞, 苑兆和, 宗世祥, 王君. 基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
Hong Wenjuan, Hao Zhaoxiang, Liu Kangjia, Luo Hua, Bi Runxia, Yuan Zhaohe, Zong Shixiang, Wang Jun. Development and identification of SSR molecular markers based on whole genomic sequences of Punica granatum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
Citation: Hong Wenjuan, Hao Zhaoxiang, Liu Kangjia, Luo Hua, Bi Runxia, Yuan Zhaohe, Zong Shixiang, Wang Jun. Development and identification of SSR molecular markers based on whole genomic sequences of Punica granatum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167

基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
基金项目: 国家林业局业务委托项目(20180001),2019校专项−科技创新服务能力建设−科研基地建设−林果业生态环境功能提升协同创新中心(2011协同创新中心)(PXM2019_014207_000099)
详细信息
    作者简介:

    洪文娟。主要研究方向:经济林品种鉴定。 Email:1368030722@qq.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学118信箱

    通讯作者:

    王君,教授,博士生导师。主要研究方向:林木细胞遗传学与染色体工程育种。Email: wangjun@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S665.4; Q943.2

Development and identification of SSR molecular markers based on whole genomic sequences of Punica granatum

  • 摘要: 目的利用cDNA文库筛选的石榴SSR多态性标记数量有限,为进一步推动石榴遗传多样性分析、遗传图谱构建、品种鉴定等研究,有必要系统开发高效稳定的分子标记位点。方法本研究根据已发表的石榴基因组测序数据利用MISA软件对1 ~ 6核苷酸重复的SSR位点进行了查找,分析了不同类型SSR位点的序列特征,进而设计引物并检测了引物的有效性和多态性。结果(1)石榴基因组中共检测到146 445个SSR位点,其中以单核苷酸重复型SSR最多(占51.95%),六核苷酸重复型最少(仅占0.38%);SSR序列以A/T碱基占主导,具有偏向性。(2)石榴基因组SSR序列长度变化范围为10 ~ 252 bp,平均长度15.48 bp。不同长度重复单元类型的SSR序列长度存在丰富变异,呈现随着重复次数增多,SSR序列丰度减少的趋势。(3)根据不同类型SSR位点设计并合成引物140对,其中119对在12份石榴种质中可扩增出有效条带,41对可产生多态性条带,PIC值在0.007 ~ 0.566之间;从中筛选出多态性较高、稳定性好的引物15对,共检测到等位基因44个,平均每个SSR位点检测到2.933 3个等位基因。结论利用石榴全基因组序列可实现SSR标记的大规模开发,并可鉴定出大量适用于石榴遗传多样性分析、遗传图谱构建、品种鉴定等研究的SSR引物。相关研究为石榴的遗传育种研究提供了丰富的SSR序列信息和标记资源。
  • 图  1  不同类型SSRs在石榴基因组最长的10条Scaffold上的数量变化

    Figure  1.  Variation in number of different SSR types in the longest 10 Scaffolds in Punica granatum genome

    图  2  石榴基因组不同长度微卫星的出现频率

    Figure  2.  Frequency of SSRs with different length in Punica granatum genome

    图  3  不同长度重复单元微卫星的序列长度变异情况

    Figure  3.  Variation in sequence length of different types of SSRs

    图  4  有效SSR位点的PIC值与SSR长度相关分析

    Figure  4.  Correlation analyses between PIC value and SSR length in the valid loci

    图  5  引物PG_66_86在12个石榴样品中的毛细管电泳检测图

    Figure  5.  Analysis of capillary electrophoresis detection of 12 samples of pomegranate with PG_66_86 primer

    表  1  石榴测试品种编号

    Table  1.   Tested varieties of Punica granatum

    编号 No.品种 Variety来源 Source
    1 ‘秋艳’ P. ‘Qiuyan’ 山东枣庄市峄城 Yicheng, Zaozhuang City, Shandong Province
    2 ‘大叶满天红’ P. ‘Dayemantianhong’ 河北元氏县 Yuanshi County, Hebei Province
    3 ‘新疆和田酸’ P. ‘Xinjianghetiansuan’ 新疆和田 Hetian, Xinjiang Autonomous Region
    4 ‘开封四季红’ P. ‘Kaifengsijihong’ 河南开封市 Kaifeng City, Henan Province
    5 ‘怀远玉石籽’ P. ‘Huaiyuanyushizi’ 安徽怀远县 Huaiyuan County, Anhui Province
    6 ‘淮北丰产青皮’ P. ‘Huaibeifengchanqingpi’ 安徽淮北市 Huaibei City, Anhui Province
    7 ‘泰山三白甜’ P. ‘Taishansanbaitian’ 山东泰安市 Taian City, Shandong Province
    8 ‘峄城粉红牡丹’ P. ‘Yichengfenhongmudan’ 山东枣庄市峄城 Yicheng, Zaozhuang City, Shandong Province
    9 ‘墨石榴’ P. ‘Moshiliu’ 山东枣庄市峄城 Yicheng, Zaozhuang City, Shandong Province
    10 ‘会理青皮软籽’ P. ‘Huiliqingpiruanzi’ 四川会理县 Huili County, Sichuan Province
    11 ‘建水红玛瑙’ P. ‘Jianshuihongmanao’ 云南建水县 Jianshui County, Yunnan Province
    12 ‘突尼斯软籽’ P. ‘Tunisiruanzi’ 突尼斯 Tunisia
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    表  2  石榴基因组中部分SSR重复单元的分布特征

    Table  2.   Feature of parts of SSR motifs in Punica granatum genome

    重复单元 Repeat motif数目 Number重复次数 Repeat time平均长度 Average length/bp比例 Proportion/%
    A/T 72 892 10 ~ 56 11.42 49.77
    C/G 3 179 10 ~ 222 15.20 2.17
    AT/TA 34 270 6 ~ 58 19.07 23.40
    CG/GC 163 6 ~ 10 13.30 0.11
    AC/GT 3 470 6 ~ 41 16.52 2.37
    AG/CT 15 671 6 ~ 126 19.96 10.70
    AAC/GTT 326 5 ~ 26 18.51 0.22
    AAG/CTT 3 458 5 ~ 43 20.61 2.36
    AAT/ATT 5 339 5 ~ 24 21.76 3.65
    ACC/GGT 323 5 ~ 12 17.63 0.22
    ACG/CGT 127 5 ~ 15 17.55 0.09
    ACT/AGT 156 5 ~ 27 19.10 0.11
    AGC/CTG 599 5 ~ 19 17.69 0.41
    AGG/CCT 1 272 5 ~ 18 18.80 0.87
    ATC/ATG 983 5 ~ 16 18.17 0.67
    CCG/CGG 173 5 ~ 15 16.63 0.12
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    表  3  筛选的15对石榴基因组SSR位点引物及多态性信息

    Table  3.   SSR site primer and polymorphic information for selected 15 pairs of pomegranate genomic groups

    引物名称
    Primer ID
    SSR类型
    Type of SSR
    重复单元
    Repeat motif
    引物序列
    Primer sequence
    等位
    基因数
    Number of alleles (Na)
    有效等位
    基因数
    Effective allelic marker number (Ne)
    Shannon
    信息指数
    Shannon diversity index (I)
    多态
    信息含量
    Polymorphic information content (PIC)
    PG_25_548 p2 (AT)9 F: ATATGGCGGCATGAGAGTTC 4.000 0 2.742 9 1.139 5 0.566
    R: GTAATAGCATGCCCTTTGCC
    PG_98_83 p2 (TA)11 F: AGGGGCAAAACCCTTACATC 5.000 0 2.285 7 1.117 1 0.525
    R: TCGGCCCAATAAATGGAAT
    PG_44_17 p3 (AGA)6 F: GGGCGAAGAATTACAGGTGA 2.000 0 1.945 9 0.679 2 0.368
    R: ATAATGGCTCCTGTGGAACG
    PG_140_166 p4 (TATC)9 F: AAAGCATGCGAAAGGATGAT 3.000 0 2.341 5 0.922 2 0.479
    R: CAATGCCAATGTTACGGATG
    PG_4_1646 p4 (AAAT)5 F: CCAAAGGATGAGGAATCGAA 2.000 0 1.882 4 0.661 6 0.359
    R: TTTGACCCGATCTACCTCGT
    PG_105_152 p4 (GTCT)7 F: CGATGTGTACAGTTGTGGGC 3.000 0 2.104 3 0.896 1 0.466
    R: CCGTTTTAGCTCCAGTCTGC
    PG_128_96 p5 (ATAGG)7 F: GAGGAGTCAATTCGACCCAA 3.000 0 2.071 9 0.860 2 0.444
    R: CATCGAATTCTATTCCCTCCC
    PG_13_2441 p5 (AGTTG)5 F: CCGTTTTGGTTTGTTCTGGT 3.000 0 1.967 5 0.792 5 0.408
    R: CTCAACTCAACTCCACTTATCTTCA
    PG_32_463 p5 (TTGTT)5 F: CCCACGTAGGAAGGTGAAAA 2.000 0 1.945 9 0.679 2 0.368
    R: GGCTGGCATTTCAGTTCAGT
    PG_47_500 p5 (AATAT)5 F: TATGCCCGGTGTTAACCAAT 2.000 0 1.945 9 0.679 2 0.368
    R: TGATCACTCACACCAGCCTC
    PG_20_939 p6 (TATAGA)6 F: GGGTCCACAACAACTCCACT 4.000 0 2.594 6 1.109 7 0.557
    R: TTTTCCATTCCTTTTCCCCT
    PG_22_2120 p6 (AATCAA)5 F: CCCCGTTTGGATTCAAAGAT 3.000 0 1.811 3 0.778 1 0.397
    R: GAGGGGAAGCTGAGACAGAG
    PG_66_86 p6 (GAGGGA)6 F: GCTGGTAGGAGTGCTTGAGG 3.000 0 2.133 3 0.829 3 0.428
    R: TTCCCCTAATTTGGTGGGTT
    PG_28_765 p6 (CAAAAT)5 F: TTGTCGACGAACTCGAACAG 2.000 0 2.000 0 0.693 1 0.375
    R: TGCATGCAGACAGCTTTAGG
    PG_117_30 C (GCA)5(GCC)8 F: GGACGAGATACGGCAGAGAC 3.000 0 1.766 9 0.723 3 0.420
    R: TGCAGAGGATTGCTGAGATG
    平均值 Mean 2.933 3 2.102 7 0.837 4 0.437
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    [19] 施婷婷, 李贤军, 程丽莉, 雷霆, 张展羽, 张煜星, 周国模, 于寒颖, 曹伟, 刘智, 江泽慧, 崔彬彬, 赵俊卉, 程金新, 黄心渊, 肖化顺, 王志玲, 刘志军, 陈伟, 杜官本, 李国平, 周志强, 宗世祥, 雷相东, 徐剑琦, 曹金珍, 郭广猛, 关德新, 张璧光, 王正, 张贵, 张则路, 张璧光, 雷洪, 杨谦, 王正, 李云, 黄群策, 郝雨, 丁立建, 刘童燕, 吴家森, 王海, 苏里坦, 骆有庆, 苏淑钗, 李云, 张彩虹, 张国华, 吴家兵, 秦广雍, 周晓燕, 张佳蕊, 金晓洁], 秦岭, 许志春, 宋南, 张慧东, 李文军, 刘大鹏, 张书香, 黄晓丽, 姜培坤, 方群, 张大红, 贺宏奎, 刘彤, 常亮, 陈晓光, 王勇, 刘建立, 刘海龙, 高黎, 姜静, 姜金仲, 李延军, 张金桐, 苏晓华, 于兴华, 张弥, 蔡学理, 冯慧, 陈燕, 王德国, 成小芳, 王谦, 陈绪和, 王安志, 尹伟伦, 张冰玉, 周梅, 朱彩霞, 陈建伟3, 亢新刚, 聂立水, 冯大领, 张连生, 张勤, 金昌杰, 梁树军, 韩士杰, 胡君艳, 崔国发, 姚国龙.  燕山板栗叶片基因组AFLP反应体系建立 . 北京林业大学学报, 2006, 28(6): 35-39.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-28
  • 修回日期:  2019-05-11
  • 网络出版日期:  2019-06-12
  • 刊出日期:  2019-08-01

基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
    基金项目:  国家林业局业务委托项目(20180001),2019校专项−科技创新服务能力建设−科研基地建设−林果业生态环境功能提升协同创新中心(2011协同创新中心)(PXM2019_014207_000099)
    作者简介:

    洪文娟。主要研究方向:经济林品种鉴定。 Email:1368030722@qq.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学118信箱

    通讯作者: 王君,教授,博士生导师。主要研究方向:林木细胞遗传学与染色体工程育种。Email: wangjun@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S665.4; Q943.2

摘要: 目的利用cDNA文库筛选的石榴SSR多态性标记数量有限,为进一步推动石榴遗传多样性分析、遗传图谱构建、品种鉴定等研究,有必要系统开发高效稳定的分子标记位点。方法本研究根据已发表的石榴基因组测序数据利用MISA软件对1 ~ 6核苷酸重复的SSR位点进行了查找,分析了不同类型SSR位点的序列特征,进而设计引物并检测了引物的有效性和多态性。结果(1)石榴基因组中共检测到146 445个SSR位点,其中以单核苷酸重复型SSR最多(占51.95%),六核苷酸重复型最少(仅占0.38%);SSR序列以A/T碱基占主导,具有偏向性。(2)石榴基因组SSR序列长度变化范围为10 ~ 252 bp,平均长度15.48 bp。不同长度重复单元类型的SSR序列长度存在丰富变异,呈现随着重复次数增多,SSR序列丰度减少的趋势。(3)根据不同类型SSR位点设计并合成引物140对,其中119对在12份石榴种质中可扩增出有效条带,41对可产生多态性条带,PIC值在0.007 ~ 0.566之间;从中筛选出多态性较高、稳定性好的引物15对,共检测到等位基因44个,平均每个SSR位点检测到2.933 3个等位基因。结论利用石榴全基因组序列可实现SSR标记的大规模开发,并可鉴定出大量适用于石榴遗传多样性分析、遗传图谱构建、品种鉴定等研究的SSR引物。相关研究为石榴的遗传育种研究提供了丰富的SSR序列信息和标记资源。

English Abstract

洪文娟, 郝兆祥, 刘康佳, 罗华, 毕润霞, 苑兆和, 宗世祥, 王君. 基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
引用本文: 洪文娟, 郝兆祥, 刘康佳, 罗华, 毕润霞, 苑兆和, 宗世祥, 王君. 基于石榴全基因组序列的SSR标记开发及鉴定[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
Hong Wenjuan, Hao Zhaoxiang, Liu Kangjia, Luo Hua, Bi Runxia, Yuan Zhaohe, Zong Shixiang, Wang Jun. Development and identification of SSR molecular markers based on whole genomic sequences of Punica granatum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
Citation: Hong Wenjuan, Hao Zhaoxiang, Liu Kangjia, Luo Hua, Bi Runxia, Yuan Zhaohe, Zong Shixiang, Wang Jun. Development and identification of SSR molecular markers based on whole genomic sequences of Punica granatum[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 38-47. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190167
  • 石榴(Punica granatum)为千屈菜科(Lythraceae)石榴属(Punica)果树,具有很高的观赏、药用和保健价值,经济、生态和社会效益巨大[1]。石榴分布范围广,栽培时间长,在长期的自然选择和人为活动下产生了丰富多样的品种和类型,但由于石榴遗传背景复杂、亲缘关系模糊,难以通过形态特征进行准确的品种鉴定,限制了石榴的品种选育和产业发展[2]。因此,加强石榴遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定技术等研究,对于保障石榴新品种选育和产业健康发展具有重要意义。

    分子标记被广泛应用于遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定。在众多分子标记技术中,简单重复序列(simple sequence repeat, SSR,也称微卫星)分子标记以其多态性高、重复性好、共显性、多等位位点变异、成本低廉等优点而受到青睐[3]。Ebrahimi等[4]利用磁珠富集法筛选鉴定了25对石榴基因组SSR引物,利用这些引物对74份来自世界各地的石榴样品成功进行了遗传分析[5]。杨健基于石榴cDNA文库检索到179个SSR位点,从中筛选出8对多态性较高的EST-SSR引物,并对38个石榴品种进行了遗传相似性分析[6]。尽管如此,适用于石榴遗传分析的SSR引物数量仍然有限,难以满足石榴多样性分析和遗传图谱构建等研究需要。2018年石榴全基因组序列的发表[7]为实现大规模SSR位点开发提供了条件。本研究以石榴全基因组序列为基础,分析了石榴基因组SSRs序列特征,并开发了大量引物信息,对不同类型SSR位点的有效性和多态性水平进行了分析,为进一步开展石榴遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定等研究奠定了基础。

    • 从山东省枣庄市石榴国家种质资源库中随机选择12个石榴品种(表1)用于SSR引物有效性和多态性水平的鉴定。采集各品种幼嫩叶片,液氮速冻后保存于− 80 ℃冰箱用于DNA提取。

      表 1  石榴测试品种编号

      Table 1.  Tested varieties of Punica granatum

      编号 No.品种 Variety来源 Source
      1 ‘秋艳’ P. ‘Qiuyan’ 山东枣庄市峄城 Yicheng, Zaozhuang City, Shandong Province
      2 ‘大叶满天红’ P. ‘Dayemantianhong’ 河北元氏县 Yuanshi County, Hebei Province
      3 ‘新疆和田酸’ P. ‘Xinjianghetiansuan’ 新疆和田 Hetian, Xinjiang Autonomous Region
      4 ‘开封四季红’ P. ‘Kaifengsijihong’ 河南开封市 Kaifeng City, Henan Province
      5 ‘怀远玉石籽’ P. ‘Huaiyuanyushizi’ 安徽怀远县 Huaiyuan County, Anhui Province
      6 ‘淮北丰产青皮’ P. ‘Huaibeifengchanqingpi’ 安徽淮北市 Huaibei City, Anhui Province
      7 ‘泰山三白甜’ P. ‘Taishansanbaitian’ 山东泰安市 Taian City, Shandong Province
      8 ‘峄城粉红牡丹’ P. ‘Yichengfenhongmudan’ 山东枣庄市峄城 Yicheng, Zaozhuang City, Shandong Province
      9 ‘墨石榴’ P. ‘Moshiliu’ 山东枣庄市峄城 Yicheng, Zaozhuang City, Shandong Province
      10 ‘会理青皮软籽’ P. ‘Huiliqingpiruanzi’ 四川会理县 Huili County, Sichuan Province
      11 ‘建水红玛瑙’ P. ‘Jianshuihongmanao’ 云南建水县 Jianshui County, Yunnan Province
      12 ‘突尼斯软籽’ P. ‘Tunisiruanzi’ 突尼斯 Tunisia
    • 参考Yuan等[7]的方法,采用改良CTAB法提取石榴测试品种的基因组DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)对DNA纯度和浓度进行测定,将A260/A280值在1.8 ~ 2.0之间的DNA样品浓度统一稀释为25 ng/μL后,保存于− 20 ℃冰箱待用。

    • 根据已发表的石榴基因组序列数据[7],利用MIcroSAtellite identification tool(MISA,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)软件对石榴基因组序列中的SSR位点进行查找。查找标准为:单、二、三、四、五、六核苷酸重复单元重复次数分别不小于10、6、5、5、5、5次,而且两个SSR之间允许的最大间隔碱基对为100 bp。

      借助Primer3软件(v2.3.7; http://primer3.sourceforge.net/)对所查找的石榴基因组SSR位点进行引物设计,参数设置为:引物长度18 ~ 27 nt,最优为20 nt;熔解温度(Tm)为59 ~ 61 ℃,最优为60 ℃;GC含量为40% ~ 60%,最优为50%;预期PCR扩增产物大小为100 ~ 280 bp。

    • 针对单、二、三、四、五、六核苷酸重复和复合型等不同类型SSRs,各随机挑选20个SSR位点,共设计140对引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成,并用12份石榴样品对其进行有效性鉴定及多态性分析。PCR反应体系为7.5 μL 2 × Taq PCR MasterMix(擎科生物公司),1.5 μL模板DNA(25 ng/μL),0.3 μL M13F(10 μM)上游引物序列结合的荧光标记物,0.06 μL(10 μM)上游引物和0.24 μL(10 μM)下游引物,5.4 μL去离子水补足15 μL的PCR反应体系。其中对M13F序列进行修饰的荧光标记分为FAM、HEX、ROX、TAMRA(睿博兴科公司)4种,以便在同一试验中检测多对引物。PCR扩增程序为:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s(30个循环);94 ℃变性30 s,53 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s(10个循环);72 ℃延伸10 min。PCR反应产物送至睿博兴科公司进行毛细管电泳检测。

    • 统计稳定且易于区分的目的条带,用POPGENE32软件计算具有多态性的SSR位点的等位基因数(Na),有效等位基因数(Ne)和Shannon信息指数(I);用CERVUS 3.0软件[8]分析各SSR位点的多态信息含量值(Polymorphic Information Content, PIC)。Pearson相关分析采用OriginPro 2018完成。

    • 基于石榴基因组测序数据对基因组中1 ~ 6核苷酸重复的SSRs进行了查找分析。共查找到146 445个SSR位点,其中复合型微卫星有19 315个。查找到的SSR位点分布于基因组2 117条Scaffold中的815条,平均每条Scaffold含有179个SSR位点,只含有1个SSR位点的Scaffold有187条。在最长的10条Scaffold上检测到了28 293个SSR位点(图1),占总位点数的19.32%,其中以单核苷酸重复型SSRs最多,占48.20%。Pearson相关分析表明Scaffold长度与查找到的SSR位点数目呈极显著正相关(r=0.991 0,P < 0.000 1)。

      图  1  不同类型SSRs在石榴基因组最长的10条Scaffold上的数量变化

      Figure 1.  Variation in number of different SSR types in the longest 10 Scaffolds in Punica granatum genome

      在石榴基因组中,平均1 871 bp出现1个SSR位点。其中,单核苷酸重复型SSR含量最多,占总数的51.95%;其次为二核苷酸重复型,占36.58%;六核苷酸重复型最少,仅占0.38%。对重复单元的碱基组合进行统计(表2),发现单核苷酸重复型SSRs以(A/T)n为主,有72 892个,占95.82%;二核苷酸重复型SSRs以(AT/TA)n最多,有34 270个,占63.97%,其次为(AG/CT)n,占29.25%;三核苷酸重复型SSRs以(AAT/ATT)n最多(5 339个),占41.85%,(ACG/CGT)n最少,仅占1.00%;四核苷酸重复型SSRs以(AAAT/ATTT)n所占比例最大,为36.77%,而(ACCC/GGGT)n和(ACCT/AGGT)n均仅查找到1个位点;五核苷酸和六核苷酸重复型SSRs中比例最高的分别为(AAAAG/CTTTT)n和(AAAATC/ATTTTG)n,分别占15.24%和32.50%。

      表 2  石榴基因组中部分SSR重复单元的分布特征

      Table 2.  Feature of parts of SSR motifs in Punica granatum genome

      重复单元 Repeat motif数目 Number重复次数 Repeat time平均长度 Average length/bp比例 Proportion/%
      A/T 72 892 10 ~ 56 11.42 49.77
      C/G 3 179 10 ~ 222 15.20 2.17
      AT/TA 34 270 6 ~ 58 19.07 23.40
      CG/GC 163 6 ~ 10 13.30 0.11
      AC/GT 3 470 6 ~ 41 16.52 2.37
      AG/CT 15 671 6 ~ 126 19.96 10.70
      AAC/GTT 326 5 ~ 26 18.51 0.22
      AAG/CTT 3 458 5 ~ 43 20.61 2.36
      AAT/ATT 5 339 5 ~ 24 21.76 3.65
      ACC/GGT 323 5 ~ 12 17.63 0.22
      ACG/CGT 127 5 ~ 15 17.55 0.09
      ACT/AGT 156 5 ~ 27 19.10 0.11
      AGC/CTG 599 5 ~ 19 17.69 0.41
      AGG/CCT 1 272 5 ~ 18 18.80 0.87
      ATC/ATG 983 5 ~ 16 18.17 0.67
      CCG/CGG 173 5 ~ 15 16.63 0.12
    • 对石榴基因组SSR序列进行分析,发现其长度变化范围为10 ~ 252 bp,平均长度15.48 bp。其中,长度为10 bp的SSR序列所占比例最大,为23.62%,其次为长度12 bp的SSR序列,占13.41%(图2)。

      图  2  石榴基因组不同长度微卫星的出现频率

      Figure 2.  Frequency of SSRs with different length in Punica granatum genome

      不同长度重复单元的SSR序列长度也存在丰富变异,均呈现随着重复次数的增多,SSR丰度减少的趋势(图3表2)。二核苷酸重复型SSR序列的长度变化范围最大(12 ~ 252 bp),平均长度为19.15 bp,其中以(AG/CT)n序列平均长度最大,为19.96 bp,(CG/GC)n平均长度最小,仅13.30 bp;单核苷酸重复型SSR序列长度变化范围为10 ~ 222 bp,平均长度为11.58 bp,其中(A/T)n平均长度为11.42 bp,(C/G)n的平均长度为15.20 bp。SSR序列的平均长度与重复单元长度呈正相关(r = 0.979 2,P < 0.000 5)。

      图  3  不同长度重复单元微卫星的序列长度变异情况

      Figure 3.  Variation in sequence length of different types of SSRs

    • 利用12份石榴样品对140对引物进行检测,有132对引物成功扩增,占94.29%。其中,12对引物条带多、峰形差,1对引物的产物小于目的片段范围,因此扩增产物与预期产物一致且较稳定的引物有119对,引物有效率为85%。

      Pearson相关分析发现,该119对引物的PIC值与SSR长度间无显著相关性(图4A)。进一步按照SSR类型分类后,发现三核苷酸和四核苷酸重复型SSR位点的PIC值与SSR长度均呈显著正相关(图4D4E),而单、二、五、六核苷酸重复型以及复合型SSR位点的PIC值与SSR长度间无显著相关性(图4B4C4F4H)。

      图  4  有效SSR位点的PIC值与SSR长度相关分析

      Figure 4.  Correlation analyses between PIC value and SSR length in the valid loci

      筛选到41对SSR引物在12份石榴样品中能扩增出多态性产物,其PIC值在0.007 ~ 0.566之间,平均为0.353。其中,PIC < 0.25的有8对,PIC在0.25 ~ 0.5之间的有29对,PIC > 0.5的有4对。进一步从中挑选出主带清晰、多态性较高、稳定性好的15对引物(表3图5)进行统计,共检测到44个等位基因,每个位点的等位基因数在2 ~ 5之间,平均等位基因数为2.933 3;有效等位基因数在1.766 9 ~ 2.742 9之间,平均为2.102 7;PIC值在0.359 ~ 0.566之间,平均为0.437,最大值为0.566,最小值为0.359;Shannon信息指数在0.661 6 ~ 1.139 5之间,平均为0.837 4。

      表 3  筛选的15对石榴基因组SSR位点引物及多态性信息

      Table 3.  SSR site primer and polymorphic information for selected 15 pairs of pomegranate genomic groups

      引物名称
      Primer ID
      SSR类型
      Type of SSR
      重复单元
      Repeat motif
      引物序列
      Primer sequence
      等位
      基因数
      Number of alleles (Na)
      有效等位
      基因数
      Effective allelic marker number (Ne)
      Shannon
      信息指数
      Shannon diversity index (I)
      多态
      信息含量
      Polymorphic information content (PIC)
      PG_25_548 p2 (AT)9 F: ATATGGCGGCATGAGAGTTC 4.000 0 2.742 9 1.139 5 0.566
      R: GTAATAGCATGCCCTTTGCC
      PG_98_83 p2 (TA)11 F: AGGGGCAAAACCCTTACATC 5.000 0 2.285 7 1.117 1 0.525
      R: TCGGCCCAATAAATGGAAT
      PG_44_17 p3 (AGA)6 F: GGGCGAAGAATTACAGGTGA 2.000 0 1.945 9 0.679 2 0.368
      R: ATAATGGCTCCTGTGGAACG
      PG_140_166 p4 (TATC)9 F: AAAGCATGCGAAAGGATGAT 3.000 0 2.341 5 0.922 2 0.479
      R: CAATGCCAATGTTACGGATG
      PG_4_1646 p4 (AAAT)5 F: CCAAAGGATGAGGAATCGAA 2.000 0 1.882 4 0.661 6 0.359
      R: TTTGACCCGATCTACCTCGT
      PG_105_152 p4 (GTCT)7 F: CGATGTGTACAGTTGTGGGC 3.000 0 2.104 3 0.896 1 0.466
      R: CCGTTTTAGCTCCAGTCTGC
      PG_128_96 p5 (ATAGG)7 F: GAGGAGTCAATTCGACCCAA 3.000 0 2.071 9 0.860 2 0.444
      R: CATCGAATTCTATTCCCTCCC
      PG_13_2441 p5 (AGTTG)5 F: CCGTTTTGGTTTGTTCTGGT 3.000 0 1.967 5 0.792 5 0.408
      R: CTCAACTCAACTCCACTTATCTTCA
      PG_32_463 p5 (TTGTT)5 F: CCCACGTAGGAAGGTGAAAA 2.000 0 1.945 9 0.679 2 0.368
      R: GGCTGGCATTTCAGTTCAGT
      PG_47_500 p5 (AATAT)5 F: TATGCCCGGTGTTAACCAAT 2.000 0 1.945 9 0.679 2 0.368
      R: TGATCACTCACACCAGCCTC
      PG_20_939 p6 (TATAGA)6 F: GGGTCCACAACAACTCCACT 4.000 0 2.594 6 1.109 7 0.557
      R: TTTTCCATTCCTTTTCCCCT
      PG_22_2120 p6 (AATCAA)5 F: CCCCGTTTGGATTCAAAGAT 3.000 0 1.811 3 0.778 1 0.397
      R: GAGGGGAAGCTGAGACAGAG
      PG_66_86 p6 (GAGGGA)6 F: GCTGGTAGGAGTGCTTGAGG 3.000 0 2.133 3 0.829 3 0.428
      R: TTCCCCTAATTTGGTGGGTT
      PG_28_765 p6 (CAAAAT)5 F: TTGTCGACGAACTCGAACAG 2.000 0 2.000 0 0.693 1 0.375
      R: TGCATGCAGACAGCTTTAGG
      PG_117_30 C (GCA)5(GCC)8 F: GGACGAGATACGGCAGAGAC 3.000 0 1.766 9 0.723 3 0.420
      R: TGCAGAGGATTGCTGAGATG
      平均值 Mean 2.933 3 2.102 7 0.837 4 0.437

      图  5  引物PG_66_86在12个石榴样品中的毛细管电泳检测图

      Figure 5.  Analysis of capillary electrophoresis detection of 12 samples of pomegranate with PG_66_86 primer

    • 随着新一代测序技术的不断应用,利用海量测序数据进行分子标记的开发和挖掘已受到广泛重视[9]。本研究利用MISA软件从石榴基因组中共查找到146 445个SSR位点,数量众多,类型多样,为我们进一步开展有效SSR位点的筛选和鉴定奠定了坚实的基础。其中,单核苷酸重复型SSR位点所占比例最高,达51.95%,而六核苷酸重复型SSR位点含量最低,仅0.38%。与杜仲(Eucommia ulmoides)等树种随着重复单元长度的增加,其含量逐渐降低的结果相似[10]。然而,对枣(Ziziphus jujuba)基因组SSR位点特征的研究却发现其优势重复类型为六核苷酸重复(40.1%)[11],可能与不同物种的基因组大小差异有关[12]

      石榴基因组SSR序列存在明显的偏好性。其中,单核苷酸重复型SSRs以(A/T)n为主,占95.82%;二核苷酸重复型SSRs以(AT/TA)n最多,占63.97%;在其他类型SSRs中也存在相似的趋势。显然,A/T碱基在石榴基因组SSR序列中占了主导地位。对水稻(Oryza sativa)等禾本科(Gramineae)植物、毛果杨(Populus trichocarpa)、杜仲、枣等植物基因组SSR序列的研究,也都得到相似的结果[10-11,13-14]。Gur-Arie等[15]认为这种现象可能与富含A/T碱基的重复序列在DNA中解链较易有关。此外,这种偏向性的结果也可能与SSR位点查找工具中的参数设置有关[16]

      石榴基因组SSR序列长度变异丰富(10 ~ 252 bp),平均长度15.48 bp,其中二核苷酸重复型SSR序列的长度变化范围最大(12 ~ 252 bp),单核苷酸重复型SSR序列长度变化范围次之,为10 ~ 222 bp。这种SSR长度的变异可能与进化过程中SSR获得(或丢失)重复单元速率的快慢有关[10]。Weber发现完美重复序列PIC值随着重复次数的增加呈现增加的趋势[17]。本研究Pearson相关分析也表明三核苷酸和四核苷酸重复型SSR位点的PIC值与SSR长度均呈显著正相关,因此,在我们未来选择SSR标记时应相应选择重复次数较多、序列较长的SSR位点,可能会获得更高的多态性水平。

      根据Botsein等[18]提出的度量基因座位变异程度高低的多态信息含量标准:当PIC < 0.25时,此位点仅表现为低度多态信息含量;当0.25 < PIC < 0.5时,此位点表现为中度的多态信息含量;当PIC > 0.5时,则该位点表现为高度的多态信息含量。本研究从140对引物中筛选出在12份石榴样品中能扩增出多态性产物的SSR引物41对,其中PIC > 0.5的仅有4对,大部分引物PIC值在0.25 ~ 0.5之间(29对)。可见,本研究所筛选的多态性SSR位点在12份样品中所携带的多态信息总体处于中等水平,这可能与所选择的12个石榴品种间差异不大有关;同时,参考Luo等[19]对136个石榴品种的SSR分析结果,13个SSR位点的PIC值仅在0.14 ~ 0.29之间,推测可能由于长期的驯化以及对芽变的利用偏向,我国石榴品种间的变异水平本身也有限。

      石榴栽培历史悠久,品种繁多,单纯以形态学差异等特征作为品种区分标准容易受到环境因素和栽培措施的影响,因此,开发分子标记指纹图谱是开展石榴品种注册、品种鉴定的主要趋势。本研究基于石榴基因组测序数据开发了大量的石榴SSR引物,为进一步开展石榴重要品种和种质的SSR指纹图谱构建奠定了基础,而且充分利用毛细管电泳检测技术成本低、污染少、精确度高等高通量检测特点[20],为实现石榴种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究提供了可靠的支撑。

参考文献 (20)

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