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杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析

霍晓薇 徐千惠 王延伟

霍晓薇, 徐千惠, 王延伟. 杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
引用本文: 霍晓薇, 徐千惠, 王延伟. 杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
Huo Xiaowei, Xu Qianhui, Wang Yanwei. Prediction of miRNA target genes in poplar and the expression analysis under low nitrogen stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
Citation: Huo Xiaowei, Xu Qianhui, Wang Yanwei. Prediction of miRNA target genes in poplar and the expression analysis under low nitrogen stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205

杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
基金项目: 国家自然科学基金项目(31670671、31470668)
详细信息
    作者简介:

    霍晓薇。主要研究方向:林木抗逆分子遗传。Email:hxw_vv@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    王延伟,博士,副教授。主要研究方向:林木抗逆分子遗传。Email:ywwang@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S792.95

Prediction of miRNA target genes in poplar and the expression analysis under low nitrogen stress

  • 摘要: 目的鉴定杨树受低氮胁迫后miRNA的靶基因,分析靶基因在氮胁迫后的差异表达并探讨其功能,为揭示杨树低氮胁迫下miRNA的调控功能提供参考,并为树木低氮营养高效利用育种提供重要的候选基因。方法根据miRNA的保守性及与靶基因的严谨互补配对关系,以杨树miRNA为探针利用靶基因预测软件psRNATarget,通过与毛白杨转录组的基因序列进行比对鉴定靶基因,进一步开展毛白杨受低氮胁迫后靶基因的差异表达分析及功能注释。结果获得了131个miRNA家族的242个miRNA成员对应的3 024个靶基因,分别参与了植物激素信号转导、次生代谢产物的生物合成、氨基酸合成代谢、碳代谢和RNA运输等通路。57个靶基因在低氮胁迫处理后发生显著变化,其中受到诱导(29个)和抑制(28个)的基因数目相当。14个低氮胁迫响应的miRNA,其对应的11个靶基因也发生了显著的差异表达变化,其中miRNA和靶基因表达量发生相反变化的有8个miRNA。本研究发现参与植物激素信号转导的靶基因(2个)及参与代谢途径的靶基因(6个)发生了差异表达。miR162的靶基因编码ABC转运蛋白,miR393运用于靶基因KAT2调节Na+和K+动态平衡,miR399的靶基因PIF3编码光敏色素互作因子PIFs蛋白,这些miRNA及靶基因可能在杨树响应低氮胁迫中发挥重要作用。结论本文鉴定到了毛白杨中一批低氮胁迫响应miRNA的靶基因,可调控杨树对氮逆境胁迫信号的反应。这些miRNA及靶基因为进一步揭示miRNA及靶基因在低氮胁迫下的调控功能提供了研究线索,为树木氮营养的高效利用改良提供了重要候选基因。
  • 图  1  靶基因数量分布图(靶基因数量 ≥ 40)

    Figure  1.  Distribution map of target gene number(more than 40)

    图  2  靶基因的GO分类

    Figure  2.  GO classification of the target genes

    图  3  差异表达靶基因功能分类

    Figure  3.  Functional classification of the target genes with differential expression

    图  4  miR162、miR396与靶基因互补位点图

    Figure  4.  The complementary sites of miR162, miR396 and the corresponding target genes

    表  1  前10显著富集的KEGG通路

    Table  1.   Top 10 significantly enriched KEGG pathways

    KEGG通路
    KEGG pathway
    差异表达基因数目
    Number of differentially expressed genes
    全部基因数目
    Total number of genes
    植物激素信号转导 Plant hormone signal transduction 85 (5.34%) 1131 (3.87%)
    植物−病原体相互作用 Plant-pathogen interaction 83 (5.21%) 1233 (4.22%)
    RNA转运 RNA transport 57 (3.58%) 849 (2.91%)
    剪接 Spliceosome 51 (3.2%) 886 (3.03%)
    内质网中的蛋白质加工 Protein processing in endoplasmic reticulum 37 (2.32%) 854 (2.92%)
    核糖体 Ribosome 75 (4.71%) 1650 (5.65%)
    次生代谢物的生物合成 Biosynthesis of secondary metabolites 158 (9.92%) 3446 (11.79%)
    碳代谢 Carbon metabolism 27 (1.69%) 863 (2.95%)
    代谢途径 Metabolic pathways 287 (18.02%) 6238 (21.35%)
    氨基酸的生物合成 Biosynthesis of amino acids 19 (1.19%) 699 (2.39%)
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    表  2  差异表达靶基因相关KEGG通路

    Table  2.   Differentially expressed target genes associated with the KEGG pathway

    通路ID  
    Pathway ID  
    KEGG通路
    KEGG pathway
    差异表达基因数量
    Number of differentially expressed genes
    差异表达基因
    Differentially expressed genes
    ko03022 基础转录因子
    Basal transcription factors
    2 (6.25%) CL570.Contig1_All, CL570.Contig3_All
    ko04120 泛素介导的蛋白水解
    Ubiquitin mediated proteolysis
    3 (9.38%) CL3618.Contig2_All, CL8020.Contig1_All, CL8020.Contig2_All
    ko00430 牛磺酸和亚牛磺酸代谢
    Taurine and hypotaurine metabolism
    1 (3.13%) CL1398.Contig4_All
    ko03040 剪接
    Spliceosome
    3 (9.38%) CL4501.Contig2_All, CL68.Contig2_All, Unigene22460_All
    ko00563 糖基磷脂酰肌醇 (GPI)-锚生物合成
    Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis
    1 (3.13%) CL4201.Contig2_All
    ko00130 泛醌和其他萜类化合物−醌生物合成
    Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis
    1 (3.13%) Unigene20018_All
    ko00510 N-聚糖生物合成
    N-Glycan biosynthesis
    1 (3.13%) Unigene3286_All
    ko04712 昼夜节律−植物
    Circadian rhythm-plant
    1 (3.13%) CL3618.Contig2_All
    ko03013 RNA转运
    RNA transport
    2 (6.25%) Unigene13760_All, Unigene38123_All
    ko00630 乙醛酸和二羧酸代谢
    Glyoxylate and dicarboxylate metabolism
    1 (3.13%) CL10733.Contig3_All
    ko04141 内质网中的蛋白质加工
    Protein processing in endoplasmic reticulum
    2 (6.25%) Unigene3286_All, Unigene34173_All
    ko00620 丙酮酸代谢
    Pyruvate metabolism
    1 (3.13%) CL10733.Contig3_All
    ko04075 植物激素信号转导
    Plant hormone signal transduction
    2 (6.25%) CL1120.Contig2_All, CL1130.Contig3_All
    ko03018 RNA降解
    RNA degradation
    1 (3.13%) Unigene38123_All
    ko04626 植物−病原体相互作用
    Plant-pathogen interaction
    2 (6.25%) CL4959.Contig2_All, Unigene36128_All
    ko03015 mRNA监测途径
    mRNA surveillance pathway
    1 (3.13%) Unigene38123_All
    ko00240 嘧啶代谢
    Pyrimidine metabolism
    1 (3.13%) CL6853.Contig2_All
    ko00230 嘌呤代谢
    Purine metabolism
    1 (3.13%) CL6853.Contig2_All
    ko01200 碳代谢
    Carbon metabolism
    1 (3.13%) CL10733.Contig3_All
    ko01100 代谢途径
    Metabolic pathways
    6 (18.75%) CL10733.Contig3_All, CL1398.Contig4_All, CL4201.Contig2_All, CL6853.Contig2_All, Unigene20018_All, Unigene3286_All
    ko01110 次生代谢物的生物合成
    Biosynthesis of secondary metabolites
    3 (9.38%) CL10733.Contig3_All, CL6853.Contig2_All, Unigene20018_All
    ko03010 核糖体
    Ribosome
    1 (3.13%) Unigene24651_All
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    表  3  参与代谢途径通路的靶基因

    Table  3.   Target genes involved in metabolic pathways

    基因编号
    Gene ID
    miRNA
    miRNA
    同源基因
    Homologous gene
    基因名称
    Gene name
    基因功能
    Gene function
    CL10733.Contig3_All miR7838 ATCG01180.1 RRN23S.2 叶绿体编码的23S核糖体
    RNA chloroplast-encoded 23S ribosomal RNA
    CL1398.Contig4_All miR1445 AT5G12200.1 PYD2 编码具有二氢嘧啶酰胺水解酶活性的蛋白质
    Encodes a protein with dihydropyrimidine amidohydrolase activity
    CL6853.Contig2_All miR393a-3p
    miR393b-3p
    AT3G27250.1 AITR1 假设蛋白质
    Hypothetical protein
    CL4201.Contig2_All miR399a AT1G66430.1 FRK3 含有无菌α基序结构域的蛋白质
    Sterile alpha motif domain-containing protein
    Unigene20018_All miR156g-j AT5G54320.1 假设蛋白(DUF295)
    hypothetical protein (DUF295)
    Unigene3286_All miR399i AT1G09530.1 PAP3 转录因子与光感受器phyA和phyB相互作用
    Transcription factor interacting with photoreceptors phyA and phyB
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    表  4  参与植物激素信号传导的靶基因

    Table  4.   Target genes involved in plant hormone signaling pathways

    miRNA miRNA靶基因编号 Target gene No.同源基因 Homologous gene基因功能 Gene function
    ptc-miR530a CL1120.Contig2_All Potri.006G272400.1 剪接因子 RSZp22(RSZP22)
    Splicing factor RSZp22 (RSZP22)
    ptc-miR396a,b CL1130.Contig3_All Potri.001G215800.1 DNAJ 热休克N-末端结构域蛋白
    DNAJ heat shock N-terminal domain-containing protein
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    表  5  低氮胁迫下差异表达的杨树miRNA和靶基因

    Table  5.   Differentially expressed miRNAs and target genes

    miRNA miRNA上调/下调* Up/down regulation差异倍数 Fold change靶基因编号 Target gene No.上调/下调 Up/down regulation
    miR482c-3p 0.67 Unigene31509_All
    miR482c-5p 0.67 Unigene30684_All
    miR168a-5p 0.58 Unigene13760_All
    miR168b-5p
    miR162a 0.65 Unigene18608_All
    miR162b
    miR393a-3p 2.56 CL6853.Contig2_All
    miR393b-3p
    miR399a 0.49 CL4201.Contig2_All
    miR6445a 0.54 Unigene37079_All
    miR6445b
    miR396a 1.7 CL1130.Contig3_All
    miR396b
    miR6445a 0.54 CL8486.Contig3_All
    miR6445b
    miR6427-3p 0.54 CL4139.Contig1_All
    miR6427-3p 0.54 Unigene24651_All
    注:* miRNA在毛白杨受低氮胁迫后的差异表达结果参考本实验室前期研究结果[37]。Note: * means miRNA differentially expressed results of Populus tomentosa under low nitrogen stress referring to the research results of our laboratory in the early stage[37].
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    表  6  miRNA和靶基因变化趋势呈负相关的预测结果

    Table  6.   Prediction of negative correlation between miRNA and target gene change trends

    miRNA
    miRNA
    靶基因编号
    Target gene No.
    同源基因(拟南芥)
    Homologous gene (Arabidopsis thaliana)
    功能
    Function
    miR482c-3p Unigene31509_All AT5G56670.1 核糖体蛋白S30家族蛋白
    Ribosomal protein S30 family protein
    miR482c-5p Unigene30684_All AT3G52105.1
    miR168a-5p,b-5p Unigene13760_All
    miR162a,b Unigene18608_All AT1G70610.1 (TAP1) 与抗原加工蛋白相关的转运蛋白1
    Transporter associated with antigen processing protein 1
    miR396a,b CL1130.Contig3_All AT5G22080.1 伴随DnaJ结构域超家族蛋白
    Chaperone DnaJ-domain superfamily protein
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    , 王晓楠, 刘玉军, 尹伟伦, 谢磊, 冯仲科, 严晓素, 高荣孚, 李凯, 郭晓萍, 冯晓峰, 温秀凤3, 于京民2, 吴坚, 赵兵, 王瑛, 王冬梅, 王玉兵, 邹坤, 骈瑞琪, 王华芳, 王建中, 李凤兰, 王民中, 丁霞, 陶凤杰, 张兴杰, 孙建华, 张庆, 刘玉军, 陈卫平, 杨伟光, 王玉春, 李镇宇, 刘艳, 林善枝, 呼晓姝, 沈应柏, 赵新丽, 付瑞海, 马建海, 蒋平, 汪植.  毛白杨叶片离体再生培养的基因型效应 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 38-43.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-30
  • 修回日期:  2019-05-20
  • 网络出版日期:  2019-07-08
  • 刊出日期:  2019-08-01

杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
    基金项目:  国家自然科学基金项目(31670671、31470668)
    作者简介:

    霍晓薇。主要研究方向:林木抗逆分子遗传。Email:hxw_vv@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 王延伟,博士,副教授。主要研究方向:林木抗逆分子遗传。Email:ywwang@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S792.95

摘要: 目的鉴定杨树受低氮胁迫后miRNA的靶基因,分析靶基因在氮胁迫后的差异表达并探讨其功能,为揭示杨树低氮胁迫下miRNA的调控功能提供参考,并为树木低氮营养高效利用育种提供重要的候选基因。方法根据miRNA的保守性及与靶基因的严谨互补配对关系,以杨树miRNA为探针利用靶基因预测软件psRNATarget,通过与毛白杨转录组的基因序列进行比对鉴定靶基因,进一步开展毛白杨受低氮胁迫后靶基因的差异表达分析及功能注释。结果获得了131个miRNA家族的242个miRNA成员对应的3 024个靶基因,分别参与了植物激素信号转导、次生代谢产物的生物合成、氨基酸合成代谢、碳代谢和RNA运输等通路。57个靶基因在低氮胁迫处理后发生显著变化,其中受到诱导(29个)和抑制(28个)的基因数目相当。14个低氮胁迫响应的miRNA,其对应的11个靶基因也发生了显著的差异表达变化,其中miRNA和靶基因表达量发生相反变化的有8个miRNA。本研究发现参与植物激素信号转导的靶基因(2个)及参与代谢途径的靶基因(6个)发生了差异表达。miR162的靶基因编码ABC转运蛋白,miR393运用于靶基因KAT2调节Na+和K+动态平衡,miR399的靶基因PIF3编码光敏色素互作因子PIFs蛋白,这些miRNA及靶基因可能在杨树响应低氮胁迫中发挥重要作用。结论本文鉴定到了毛白杨中一批低氮胁迫响应miRNA的靶基因,可调控杨树对氮逆境胁迫信号的反应。这些miRNA及靶基因为进一步揭示miRNA及靶基因在低氮胁迫下的调控功能提供了研究线索,为树木氮营养的高效利用改良提供了重要候选基因。

English Abstract

霍晓薇, 徐千惠, 王延伟. 杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
引用本文: 霍晓薇, 徐千惠, 王延伟. 杨树miRNA的靶基因预测及低氮胁迫表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
Huo Xiaowei, Xu Qianhui, Wang Yanwei. Prediction of miRNA target genes in poplar and the expression analysis under low nitrogen stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
Citation: Huo Xiaowei, Xu Qianhui, Wang Yanwei. Prediction of miRNA target genes in poplar and the expression analysis under low nitrogen stress[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(8): 28-37. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190205
  • miRNA是一类长度18 ~ 24 nt的内源性非编码小分子RNA,广泛存在于动植物基因组中,是真核生物基因表达负调控子,通过介导靶基因mRNA的切割或者翻译抑制,从而在转录后水平发挥作用[1]。miRNA参与调控植物器官的形态建成、植物生长发育、蛋白质降解、信号转导、激素分泌以及对外界环境胁迫的响应等重要的生物过程[2-3]。miRNA通过对靶基因调控而发挥作用,因而系统鉴定靶基因是研究miRNA功能的基础[4]。随着生物信息学的发展,人们对miRNA调节机制的研究不断深入。与动物miRNA相比,植物miRNA成熟序列与靶基因识别位点高度互补,绝大部分通过切割靶基因来抑制其表达[5-10],研究者根据植物miRNA的特点开发了多种预测软件,例如PatScan[11]、Target Finder[12]、psRNATarget[13]和miRNAassist[14]等。其中,psRNATarget因其高效分布式的算法满足对二代测序数据高通量分析的要求,是最常使用的预测工具之一。

    氮素是植物生长最重要的矿质元素之一,决定了植物的生长与产量的形成,同时也是蛋白质、氨基酸、激素、核酸、酶、叶绿素、维生素、生物碱以及其他相关代谢产物的主要成分[15]。在低氮条件下,氮素是作为叶绿素的组成成分合成受阻,影响了植物的光合速率,进而阻碍光合产物的形成,降低了植物生长速度以及农作物的产量。除此之外,植物激素中也含有氮素,例如赤霉素和细胞分裂素等[15-16]

    植物对氮元素吸收的机制比较复杂,前人研究已鉴定到一些氮高效利用相关转录因子和调控原件,如ANR1(anaerobic response 1)和DOF1(DNA binding with one finger)。ANR1是NO3刺激侧根增殖信号转导途径的主要组成部分,可调控拟南芥(Arabidopsis thaliana)侧根发育[17-21]。DOF1可调控碳氮代谢途径中的多个关键基因,在拟南芥中过量表达可以增加植株耐受低氮胁迫的能力[22],在烟草中参与生长素应答基因的表达[23],在玉米(Zea mays)中可促进对氮素的吸收[24]。此外,植物在响应低氮胁迫过程中还受到miRNA的调控。miR393能够被硝酸盐诱导表达,进而调控拟南芥根部的生长素受体基因[25]。在水稻(Oryza sativa)中也发现miR167a-3p、miR167、miR166i-5p、miR169c、miR169b、miR531、miR815、miR439j和miR1863b等9个在低氮胁迫中下调或上调表达的miRNA[26]。miR169参与蒺藜(Tribulus terrester)根瘤的发育,miR167的靶基因ARF6和ARF8调控植物侧根发育,例如用硝酸盐处理拟南芥,miR167表达量下降,而其靶基因ARF8表达上升,进而诱导了侧根的发育[27-28]。miR167的另一个靶基因IAR3可使吲哚-3-乙酸−丙氨酸水解生成生长素,miR167可通过调控靶基因来影响植物的生长[29-30]。miR167在低氮条件下上调表达,而不同的组织中miR167前体基因的变化不同[31]。miR169和miR398的表达量在低氮条件下上升,能调控控制侧根结构的靶基因ARF8的表达,miR169则能剪切调控根瘤原基分化的基因HAP2-1的mRNA[32]。还有研究表明拟南芥在低硝酸盐胁迫下,miRNA169大幅下调,而其靶基因NFYA家族大幅上调[33]。但在另一研究中发现miR167并未呈现低氮胁迫响应的表达模式[32],说明植物对低氮胁迫的响应存在复杂的调控机制。

    至今,对植物与低氮胁迫关系的研究还仅仅局限于拟南芥和水稻等草本植物,在木本植物中的研究较少开展。本文利用杨树(Populus)miRNA数据进行低氮胁迫下杨树靶基因的预测并进行生物信息分析,获得了131个miRNA家族的242个miRNA成员对应的3 024个靶基因,发现参与植物激素信号转导的2个靶基因及参与代谢途径的6个基因发生了差异表达,这些基因可能是研究植物响应低氮胁迫调控机制的关键基因。上述结果为进一步揭示miRNA及靶基因在低氮胁迫下的功能提供了研究线索,为树木氮营养的高效利用改良提供了重要候选基因。

    • 利用miRBase数据库(http://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl)获得杨树miRNA序列,从NCBI数据库下载毛白杨在低氮胁迫处理和非处理后的两类转录组数据(登录号:SRP063920),通过miRNA的靶基因预测软件psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)来预测毛白杨的靶基因[34]。参数设置除期望值为3外,其他均为默认参数。

    • 对上述预测的靶基因进行了Gene Ontology注释(http://www.geneontology.org/)和KEGG代谢通路分析(http://www.genome.jp/kegg/)。靶基因的功能注释信息利用Blast2GO比对得到,基因的GO注释通过数据库里的映射关系得到,利用作图软件BGI WEGO进行了GO功能分类,统计了靶基因在细胞组成、分子功能和生物过程中的富集情况。然后,进行KEGG代谢通路分析,Blast得到对应的KO号,分析杨树在低氮胁迫下不同的代谢通路富集情况。

    • 采用RPKM统计法计算靶基因的表达量,满足2倍上调或者下调且FDR ≤ 0.001的基因作为差异表达基因[35]。对筛选出来的靶基因进行GO和KEGG富集分析,方法同上。

    • 通过靶基因预测软件psRNATargat,共预测到3 926个靶基因,131个miRNA家族的242个miRNA成员对应总共3 024个靶基因。靶基因的总数超过40的miRNA家族有28个(图1),分别为miR156、miR172、miR396、miR478、miR169、miR482、miR476、miR475、miR397、miR399、miR530、miR395、miR171、miR319、miR159、miR477、miR472、miR6457、miR473、miR6459、miR6439、miR403、miR160、miR394、miR6425、miR164、miR6462和miR6464。其中,miR169家族是杨树中规模最大的miRNA家族,共包括34个miRNA成员,但其预测到的靶基因数目只有145个,而预测到靶基因数目最多的是miRNA156家族,共预测到215个靶基因。

      图  1  靶基因数量分布图(靶基因数量 ≥ 40)

      Figure 1.  Distribution map of target gene number(more than 40)

    • 为了分析靶基因的作用,通过GO注释和KEGG代谢通路分析,进一步获得miRNA靶基因的功能注释。获得GO注释的靶基因分别映射到细胞组成、生物过程和分子功能3个分类中的51个term,包括细胞组成分类的23个GO term,生物过程分类的15个GO term和分子功能分类的13个GO term(图2)。其中,预测到的靶基因大多数聚集在细胞(cell;1917)、细胞组分(cell part;1917)、细胞过程(cellular process;1641)、细胞器官(organelle;1593)、代谢过程(metabolic process;1561)等过程。这些过程涉及植物体基本的生理过程,对植物在营养胁迫后的生长调控可能有重要影响。

      图  2  靶基因的GO分类

      Figure 2.  GO classification of the target genes

    • 在KEGG代谢通路分析中,共有939个靶基因注释到了20条通路中,包括植物激素信号转导、次生代谢产物的生物合成、氨基酸合成代谢、碳代谢和RNA运输等通路(见表1)。其中,植物激素信号转导途径和碳代谢途径在以往报道中与植物在低氮胁迫下的响应有关。有趣的是,植物病原物互作的通路也受到了显著富集,推测可能是杨树在受到氮胁迫处理后,也诱导了生物胁迫相关基因。

      表 1  前10显著富集的KEGG通路

      Table 1.  Top 10 significantly enriched KEGG pathways

      KEGG通路
      KEGG pathway
      差异表达基因数目
      Number of differentially expressed genes
      全部基因数目
      Total number of genes
      植物激素信号转导 Plant hormone signal transduction 85 (5.34%) 1131 (3.87%)
      植物−病原体相互作用 Plant-pathogen interaction 83 (5.21%) 1233 (4.22%)
      RNA转运 RNA transport 57 (3.58%) 849 (2.91%)
      剪接 Spliceosome 51 (3.2%) 886 (3.03%)
      内质网中的蛋白质加工 Protein processing in endoplasmic reticulum 37 (2.32%) 854 (2.92%)
      核糖体 Ribosome 75 (4.71%) 1650 (5.65%)
      次生代谢物的生物合成 Biosynthesis of secondary metabolites 158 (9.92%) 3446 (11.79%)
      碳代谢 Carbon metabolism 27 (1.69%) 863 (2.95%)
      代谢途径 Metabolic pathways 287 (18.02%) 6238 (21.35%)
      氨基酸的生物合成 Biosynthesis of amino acids 19 (1.19%) 699 (2.39%)
    • 在鉴定miRNA靶基因的基础上,进一步研究了这些靶基因在杨树受低氮胁迫处理后的差异表达变化。结果发现57个靶基因在低氮胁迫处理后发生显著变化,其中受到诱导(29个)和抑制(28个)的基因数目相当。GO富集性结果进一步表明,45个差异表达的靶基因获得了GO注释,共映射到了35个GO term中(图3)。在细胞组成分类中主要是富集于细胞(cell)、细胞器官(organelle)和细胞组分(cell part)。生物过程分类中主要富集于细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)、单一生物过程(single-organism process)和对刺激的响应(response to stimulus)。在分子功能分类中主要富集于结合(binding)、催化活性(catalytic activity)。

      图  3  差异表达靶基因功能分类

      Figure 3.  Functional classification of the target genes with differential expression

      差异表达靶基因的KEGG的富集分析中,有32个差异表达靶基因映射到了共22个代谢通路(表2)。其中,注释到代谢途径通路的靶基因有6个(表3),注释到植物激素信号转导途径的靶基因有2个(表4)。

      表 2  差异表达靶基因相关KEGG通路

      Table 2.  Differentially expressed target genes associated with the KEGG pathway

      通路ID  
      Pathway ID  
      KEGG通路
      KEGG pathway
      差异表达基因数量
      Number of differentially expressed genes
      差异表达基因
      Differentially expressed genes
      ko03022 基础转录因子
      Basal transcription factors
      2 (6.25%) CL570.Contig1_All, CL570.Contig3_All
      ko04120 泛素介导的蛋白水解
      Ubiquitin mediated proteolysis
      3 (9.38%) CL3618.Contig2_All, CL8020.Contig1_All, CL8020.Contig2_All
      ko00430 牛磺酸和亚牛磺酸代谢
      Taurine and hypotaurine metabolism
      1 (3.13%) CL1398.Contig4_All
      ko03040 剪接
      Spliceosome
      3 (9.38%) CL4501.Contig2_All, CL68.Contig2_All, Unigene22460_All
      ko00563 糖基磷脂酰肌醇 (GPI)-锚生物合成
      Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis
      1 (3.13%) CL4201.Contig2_All
      ko00130 泛醌和其他萜类化合物−醌生物合成
      Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis
      1 (3.13%) Unigene20018_All
      ko00510 N-聚糖生物合成
      N-Glycan biosynthesis
      1 (3.13%) Unigene3286_All
      ko04712 昼夜节律−植物
      Circadian rhythm-plant
      1 (3.13%) CL3618.Contig2_All
      ko03013 RNA转运
      RNA transport
      2 (6.25%) Unigene13760_All, Unigene38123_All
      ko00630 乙醛酸和二羧酸代谢
      Glyoxylate and dicarboxylate metabolism
      1 (3.13%) CL10733.Contig3_All
      ko04141 内质网中的蛋白质加工
      Protein processing in endoplasmic reticulum
      2 (6.25%) Unigene3286_All, Unigene34173_All
      ko00620 丙酮酸代谢
      Pyruvate metabolism
      1 (3.13%) CL10733.Contig3_All
      ko04075 植物激素信号转导
      Plant hormone signal transduction
      2 (6.25%) CL1120.Contig2_All, CL1130.Contig3_All
      ko03018 RNA降解
      RNA degradation
      1 (3.13%) Unigene38123_All
      ko04626 植物−病原体相互作用
      Plant-pathogen interaction
      2 (6.25%) CL4959.Contig2_All, Unigene36128_All
      ko03015 mRNA监测途径
      mRNA surveillance pathway
      1 (3.13%) Unigene38123_All
      ko00240 嘧啶代谢
      Pyrimidine metabolism
      1 (3.13%) CL6853.Contig2_All
      ko00230 嘌呤代谢
      Purine metabolism
      1 (3.13%) CL6853.Contig2_All
      ko01200 碳代谢
      Carbon metabolism
      1 (3.13%) CL10733.Contig3_All
      ko01100 代谢途径
      Metabolic pathways
      6 (18.75%) CL10733.Contig3_All, CL1398.Contig4_All, CL4201.Contig2_All, CL6853.Contig2_All, Unigene20018_All, Unigene3286_All
      ko01110 次生代谢物的生物合成
      Biosynthesis of secondary metabolites
      3 (9.38%) CL10733.Contig3_All, CL6853.Contig2_All, Unigene20018_All
      ko03010 核糖体
      Ribosome
      1 (3.13%) Unigene24651_All

      表 3  参与代谢途径通路的靶基因

      Table 3.  Target genes involved in metabolic pathways

      基因编号
      Gene ID
      miRNA
      miRNA
      同源基因
      Homologous gene
      基因名称
      Gene name
      基因功能
      Gene function
      CL10733.Contig3_All miR7838 ATCG01180.1 RRN23S.2 叶绿体编码的23S核糖体
      RNA chloroplast-encoded 23S ribosomal RNA
      CL1398.Contig4_All miR1445 AT5G12200.1 PYD2 编码具有二氢嘧啶酰胺水解酶活性的蛋白质
      Encodes a protein with dihydropyrimidine amidohydrolase activity
      CL6853.Contig2_All miR393a-3p
      miR393b-3p
      AT3G27250.1 AITR1 假设蛋白质
      Hypothetical protein
      CL4201.Contig2_All miR399a AT1G66430.1 FRK3 含有无菌α基序结构域的蛋白质
      Sterile alpha motif domain-containing protein
      Unigene20018_All miR156g-j AT5G54320.1 假设蛋白(DUF295)
      hypothetical protein (DUF295)
      Unigene3286_All miR399i AT1G09530.1 PAP3 转录因子与光感受器phyA和phyB相互作用
      Transcription factor interacting with photoreceptors phyA and phyB

      表 4  参与植物激素信号传导的靶基因

      Table 4.  Target genes involved in plant hormone signaling pathways

      miRNA miRNA靶基因编号 Target gene No.同源基因 Homologous gene基因功能 Gene function
      ptc-miR530a CL1120.Contig2_All Potri.006G272400.1 剪接因子 RSZp22(RSZP22)
      Splicing factor RSZp22 (RSZP22)
      ptc-miR396a,b CL1130.Contig3_All Potri.001G215800.1 DNAJ 热休克N-末端结构域蛋白
      DNAJ heat shock N-terminal domain-containing protein
    • 前人研究表明,miRNA是靶基因表达的负向调控子。为了分析杨树在低氮胁迫后miRNA与靶基因的调控关系,在本实验室前期对低氮胁迫miRNA表达谱鉴定的基础上[36],本研究进一步分析了杨树中响应低氮胁迫miRNA的靶基因表达模式,结果表明14个低氮胁迫响应的miRNA,其对应的11个靶基因也发生了显著的差异表达变化,包括miR162a、miR162b、miR168a-5p、miR168b-5p、miR393a-3p、miR393b-3p、miR399a、miR482c-5p、miR482c-3p、miR6427-3p、miR6445a、miR6445b、miR396a、miR396b(表5)。其中miRNA和靶基因表达量发生相反变化的有8个miRNA:miR162a、miR162b、miR168a-5p、miR168b-5p、miR482c-5p、miR482c-3p、miR396a和miR396b(表6)。针对这8个miRNA,分析了其靶基因的相关功能和部分miRNA与靶基因互补位点(表6图4)。

      图  4  miR162、miR396与靶基因互补位点图

      Figure 4.  The complementary sites of miR162, miR396 and the corresponding target genes

      表 5  低氮胁迫下差异表达的杨树miRNA和靶基因

      Table 5.  Differentially expressed miRNAs and target genes

      miRNA miRNA上调/下调* Up/down regulation差异倍数 Fold change靶基因编号 Target gene No.上调/下调 Up/down regulation
      miR482c-3p 0.67 Unigene31509_All
      miR482c-5p 0.67 Unigene30684_All
      miR168a-5p 0.58 Unigene13760_All
      miR168b-5p
      miR162a 0.65 Unigene18608_All
      miR162b
      miR393a-3p 2.56 CL6853.Contig2_All
      miR393b-3p
      miR399a 0.49 CL4201.Contig2_All
      miR6445a 0.54 Unigene37079_All
      miR6445b
      miR396a 1.7 CL1130.Contig3_All
      miR396b
      miR6445a 0.54 CL8486.Contig3_All
      miR6445b
      miR6427-3p 0.54 CL4139.Contig1_All
      miR6427-3p 0.54 Unigene24651_All
      注:* miRNA在毛白杨受低氮胁迫后的差异表达结果参考本实验室前期研究结果[37]。Note: * means miRNA differentially expressed results of Populus tomentosa under low nitrogen stress referring to the research results of our laboratory in the early stage[37].

      表 6  miRNA和靶基因变化趋势呈负相关的预测结果

      Table 6.  Prediction of negative correlation between miRNA and target gene change trends

      miRNA
      miRNA
      靶基因编号
      Target gene No.
      同源基因(拟南芥)
      Homologous gene (Arabidopsis thaliana)
      功能
      Function
      miR482c-3p Unigene31509_All AT5G56670.1 核糖体蛋白S30家族蛋白
      Ribosomal protein S30 family protein
      miR482c-5p Unigene30684_All AT3G52105.1
      miR168a-5p,b-5p Unigene13760_All
      miR162a,b Unigene18608_All AT1G70610.1 (TAP1) 与抗原加工蛋白相关的转运蛋白1
      Transporter associated with antigen processing protein 1
      miR396a,b CL1130.Contig3_All AT5G22080.1 伴随DnaJ结构域超家族蛋白
      Chaperone DnaJ-domain superfamily protein

      本研究中,植物激素信号转导途径在miRNA靶基因中显著富集。前人研究证明miRNA是激素信号转导途径中的一个重要调控因子。miR396是植物中公认的一类保守性miRNA,可对多种逆境胁迫作出响应[34]。本研究中杨树miRNA396的靶基因参与了植物激素信号转导通路,miRNA396发生了上调而其靶基因发生了下调,miRNA可能对低氮胁迫起到正调控的作用。miR393在前人的研究中也曾报道过受硝酸盐的诱导与植物根系的形成有关,在本研究中miR393的靶基因发生了上调,说明miRNA393在杨树在低氮条件下中可能起重要作用。

    • 氮素是蛋白质、磷脂、核酸等与植物生长发育相关的有机氮化合物的组成部分,这些化合物是供细胞生存的结构和功能组成成分。一些生物激素含氮或者是由氮的化合物衍生而来。在前人研究中,发现miR393受硝酸盐的诱导,其靶基因编码生成转录因子TIR1、AFB1、AFB2和AFB3。AFB3在根中受硝酸盐调节,在硝酸盐处理下AFB3的突变体和miR393的基因过表达植株的主根和侧根都发生了一定的变化,说明AFB3可以调节根系的结构。miR393和AFB3之间存在的调控模式有一种被硝酸盐诱导但又被还原及同化过程中产生的氮代谢产物产生阻遏效果的前馈调节机制,这是唯一一种在拟南芥中存在的通过内源氮利用和外源氮利用以调节植物根系结构的模式[25]。本研究在关于miR393的靶基因的分析中共发现28个靶基因涉及的通路主要是代谢通路、核糖体蛋白合成、次生代谢产物的生物合成和N-聚糖生物合成通路。根据靶基因的差异表达分析,鉴定出了1个差异表达的靶基因(CL6853.Contig2_All)KAT2,涉及到内向整流的K+通道,调节Na+和K+动态平衡[38],可能在杨树响应低氮胁迫中起作用。差异表达的靶基因可能通过改变自身的表达或者通过调控其他基因的表达来响应低氮营养胁迫进而维持自身生长。

      在本研究中,代谢途径中涉及的靶基因有6个(CL10733.Contig3_All、CL1398.Contig4_All、CL4201.Contig2_All、CL6853.Contig2_All、Unigene20018_All、Unigene3286_All)。已知黄酮类化合物在植物生长发育过程中参与防御和抗逆胁迫,是一类多酚类次生代谢产物[39]。Stewart等[40]的研究证明,拟南芥和西红柿(Lycopersicon esculentum)幼苗在低氮条件下黄酮醇类的化合物会逐渐增加并积累。Leser等[41]的研究证明了在缺氮条件下黄酮醇浓度在苹果(Malus)叶片中会增加。氮素可能参与了代谢途径从而影响了植物体对低氮胁迫的响应[41-42]。本研究中,植物激素信号转导途径在miRNA靶基因中显著富集。植物激素有着复杂的信号途径,并受着多种调控因子的作用,已证明miRNA是其中一个重要的调控因子,比如miR396家族靶基因参与了植物激素信号转导通路。miR396在植物中属于保守性miRNA,前人研究证明在调控植物叶片形成等细胞分化过程中miR396发挥着极其重要的作用,miR396还与多种逆境胁迫响应过程相关。miR396的启动子区不仅含有有起始功能的TATA-box和CAAT-box,还有一些顺式作用元件与逆境胁迫相关[37],前人在对玉米、拟南芥的研究中鉴定到与低氮胁迫有密切关系的miR167、miR169和miR396[32],在本研究中发现miR396a和miR396b的靶基因(CL1130.Contig3_All)也发生了下调,该靶基因参与了激素信号通路,而mi396表达量发生了上调变化。以往研究表明低氮胁迫后miR167a可调控其靶基因ARF8的表达,改变了侧根的结构,所以miR167a在低氮的条件下可以影响侧根的生长[27]。杨树miR167和miRNA169在低氮胁迫后表达量下调[32],但本研究发现其靶基因并没有发生显著表达变化,这说明杨树miR167和miR169对低氮胁迫的响应可能存在着复杂的调控机制。

      在预测的靶基因中,miR162的靶基因(Unigene18608_All)发生了明显的差异表达,但在前人的研究中并没有具体的阐述,其靶基因编码ABC转运蛋白(TAP1)。在动物中TAP1是一种抗原加工的转运蛋白[43],本研究推测该靶基因可能与杨树响应氮胁迫的防御机制有关系。值得注意的还有miR399,其靶基因PIF3(AT1G09530.1)发生了明显上调,PIF3属于PIFs家族,PIFs(phyto-chrome-interacting factors,PIFs)蛋白家族作为光敏色素的互作因子,不仅在光及温度介导的环境信号传递中起到负调控的作用,还参与植物内源信号途径,如生长素、脱落酸、赤霉素等,与各个信号通路之间协同调控植物的生长发育[44-45]。据此我们推测mi399的靶基因可能参与杨树响应低氮胁迫的过程。综上,本文鉴定到的这些miRNA的靶基因有可能为后期靶基因在杨树低氮胁迫调控中的功能解析的进一步研究提供一定的线索,为miRNA及靶基因在杨树营养高效利用育种提供重要的候选基因。

参考文献 (45)

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