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茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究

郭烨 崔艳红 孔德仓 曹明 庞晓明 李颖岳

郭烨, 崔艳红, 孔德仓, 曹明, 庞晓明, 李颖岳. 茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
引用本文: 郭烨, 崔艳红, 孔德仓, 曹明, 庞晓明, 李颖岳. 茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
Guo Ye, Cui Yanhong, Kong Decang, Cao Ming, Pang Xiaoming, Li Yingyue. Study on key techniques of polyploid induction in Ziziphus jujuba Mill. cv. ‘Teapot’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
Citation: Guo Ye, Cui Yanhong, Kong Decang, Cao Ming, Pang Xiaoming, Li Yingyue. Study on key techniques of polyploid induction in Ziziphus jujuba Mill. cv. ‘Teapot’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230

茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
基金项目: 国家重点研发计划项目(2018YFD1000607)
详细信息
    作者简介:

    郭烨。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:guoye1630@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物学院

    通讯作者:

    李颖岳,博士,教授。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:yingyueli@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S722.3

Study on key techniques of polyploid induction in Ziziphus jujuba Mill. cv. ‘Teapot’

  • 摘要: 目的离体多倍体育种是枣树育种的重要方法,对其关键技术的研究有利于建立和完善枣树离体多倍体育种体系,加快枣树多倍体种质的创制。方法以茶壶枣无菌叶片为材料,将预培养不同天数(7 ~ 20 d)的叶片固定后制成石蜡切片,进行细胞学观察以确定适宜的预培养时间。在此基础上,将叶片不定芽再生技术与秋水仙素染色体加倍技术相结合,在叶片预培养8、9、10、11 d后,分别用70和90 mg/L的秋水仙素处理48和72 h,并对处理后得到的不定芽进行流式细胞术倍性检测。结果通过对叶片最佳预培养时间的细胞学研究可以得出,茶壶枣无菌叶片在预培养8 ~ 9 d时,分生细胞的分裂能力最强,且未出现分化现象,在此时期用秋水仙素对叶片进行处理,可大大提高诱导率,并且可以有效避免嵌合体和混倍体的出现。染色体加倍试验发现,在预培养8 d后,用70 mg/L的秋水仙素处理72 h,其诱导率最高,达4.11%,并成功获得8株多倍体植株。通过流式细胞术确定这8株多倍体均为纯合四倍体。结论本研究探索出了将茶壶枣叶片不定芽再生体系与秋水仙素染色体加倍技术相结合,人工诱导茶壶枣多倍体的技术方法。
  • 图  1  茶壶枣离体多倍体诱导过程中不同预培养时间的叶片

    a. 预培养7 d;b. 预培养9 d;c. 预培养11 d;d. 预培养13 d;e. 预培养15 d;f. 预培养20 d。a, 7 days pre-culture time; b, 9 days pre-culture time; c, 11 days pre-culture time; d, 13 days pre-culture; e, 15 days pre-culture; f, 20 days pre-culture.

    Figure  1.  Leaves of different pre-cultivation time during in vitro polyploid induction of ‘Teapot’ jujube

    图  2  茶壶枣叶片不同预培养时间的组织学观察

    a. 预培养7 d;b、c. 预培养8、9 d;d、e、f. 预培养10、11、12 d;g、h. 预培养13、14 d;i. 预培养20 d。a, 7 days pre-culture time; b, c, 8, 9 days pre-culture time, respectively; d, e, f, 10, 11, 12 days pre-culture time; g, h, 13, 14 days pre-culture time; i, 20 days pre-culture time.

    Figure  2.  Histological observation on different pre-culture time of ‘Teapot’ jujube leaves

    图  3  秋水仙素浓度及处理时间对外植体存活率的影响

    Figure  3.  Effects of colchicine concentration and colchicine treatment time on the explant survival rate

    图  4  秋水仙素浓度及处理时间对不定芽再生数的影响

    Figure  4.  Effects of colchicine concentration and colchicine treatment time on the number of adventitious bud regeneration

    图  5  流式细胞仪倍性分析图

    Figure  5.  Analysis diagram of ploidy by FCM

    表  1  秋水仙素处理茶壶枣组培苗叶片诱导多倍体处理设计表

    Table  1.   Design table of ‘Teapot’ jujube leaves with colchicine treatments

    处理
    Treatment
    预培养时间
    Pre-culture
    time/d
    秋水仙素浓度
    Colchicine concentration/
    (mg·L− 1)
    秋水仙素处理时间
    Colchicine treatment
    time/h
    1 8 70 48
    2 8 70 72
    3 8 90 48
    4 8 90 72
    5 9 70 48
    6 9 70 72
    7 9 90 48
    8 9 90 72
    9 10 70 48
    10 10 70 72
    11 10 90 48
    12 10 90 72
    13 11 70 48
    14 11 70 72
    15 11 90 48
    16 11 90 72
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    表  2  秋水仙素处理对茶壶枣叶片存活率、再生芽数以及四倍体诱导率的影响

    Table  2.   Effects of colchicine treatment on leaf survival rate, number of regenerated buds and tetraploid induction rate in ‘Teapot’ jujube

    处理
    Treatment
    外植体存活率
    Explant survival rate/%
    再生芽数
    Regenerated
    buds
    四倍体诱导率
    Tetraploid induction rate/%
    1 83.33 ± 1.25a 8.40 ± 0.41df 0
    2 69.33 ± 1.46ab 5.60 ± 0.48bcd 4.11
    3 62.33 ± 1.79bc 6.30 ± 0.31df 0
    4 52.00 ± 2.14cde 5.10 ± 0.53a 0
    5 80.60 ± 2.31a 7.98 ± 0.21df 0
    6 62.67 ± 3.21bc 6.21 ± 0.55cdf 1.37
    7 56.67 ± 7.27bcde 6.10 ± 0.54cdf 0
    8 40.67 ± 6.26e 5.40 ± 0.32a 0
    9 70.67 ± 3.73ab 8.40 ± 0.31f 0
    10 59 ± 11.88cdef 6.50 ± 0.81df 0
    11 55.33 ± 4.945bcd 6.30 ± 0.67df 0
    12 45.00 ± 0.91de 5.50 ± 0.62ab 0
    13 79.40 ± 1.57a 7.88 ± 0.29df 0
    14 65.33 ± 7.83bcd 6.45 ± 0.24df 0
    15 60.33 ± 5.51bcd 6.70 ± 0.33df 0
    16 45.23 ± 2.61de 5.70 ± 0.3abc 0
    注:不同的小写字母表示差异显著,P < 0.05。下同。Notes: different lowercase letters indicate a significant difference at P < 0.05 level. The same below.
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    表  3  秋水仙素处理茶壶枣叶片外植体存活率的方差分析

    Table  3.   Variance analysis of explant survival rate on colchicines treatment of ‘Teapot’ jujube

    变异来源 Source of variation自由度 Degree of freedom (df)均方 Mean square (MS)F
    预处理时间 Pre-culture time 3 102.702 2.498
    秋水仙素浓度 Colchicine concentration 1 2 238.692 54.443**
    秋水仙素处理时间 Colchicine treatment time 1 1 279.600 31.119**
    随机误差 Random error 31 41.120
    总计 Total 36
    注:**表示达到极显著差异,P < 0.01。下同。Notes: ** indicates extremely significant difference at P < 0.01 level. The same below.
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    表  4  秋水仙素处理茶壶枣叶片外植体再生芽数的方差分析

    Table  4.   Variance analysis of explant survival rate on colchicine treatment of ‘Teapot’ jujube

    变异来源 Source of variation自由度 Degree of freedom (df)均方 Mean square (MS)F
    预处理时期 Pre-culture time 3 0.318 0.527
    秋水仙素浓度 Colchicine concentration 1 20.358 20.358**
    秋水仙素处理时间 Colchicine treatment time 1 24.225 40.111**
    随机误差 Random error 32 0.645
    总计 Total 37
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    [18] 郝晨, 孙青, 贺窑青, 王丰俊, 刘美芹, 乔海莉, 胡海英, 隋金玲, 周章义, 段旭良, 欧阳杰, 张玲, 陈佳, 程堂仁, 李艳华, 熊丹, 孙月琴, 石娟, 雷庆哲, 王莉, 李在留, 范丙友, 胡晓丹, 刘丽, 金莹, 李莉, 曲红, 姚娜, 尹伟伦, 陆海, 张艳霞, 张志毅, 续九如, 骆有庆, 李凤兰, 冯秀兰, 王建中, 张香, 郑彩霞, 赵亚美, 阎伟, 田呈明, 冯菁, 孙爱东, 沈昕, 尹伟伦, 骆有庆, 路端正, 张德权, 李云, 郭锐, 康向阳, 武彦文, 周燕, 陈晓阳, 陈发菊, 武海卫, 王华芳, 蒋湘宁, 赵蕾, 王百田, 马钦彦, 骆有庆, 梁宏伟, 胡德夫, 姜金仲, 郑永唐, 卢存福, 沈繁宜, 吴晓成, 李忠秋, 郝俊, 王晓东, 胡晓丹, 阎晓磊, 高述民, 史玲玲, 安新民, 骆有庆, 孙爱东, 梁华军, 赵兵, 王华芳, 温秀凤3, 邹坤, 冯仲科, 尹伟伦, 崔彬彬
    , 吴坚, 郭晓萍, 高荣孚, 刘玉军, 冯晓峰, 骈瑞琪, 王建中, 王晓楠, 李凯, 严晓素, 王玉兵, 谢磊, 于京民2, 王冬梅, 张志翔, 王瑛, 呼晓姝, 王玉春, 刘玉军, 陶凤杰, 孙建华, 陈卫平, 王民中, 张兴杰, 李镇宇, 刘艳, 沈应柏, 李凤兰, 杨伟光, 张庆, 丁霞, 林善枝, 汪植, 付瑞海, 蒋平, 赵新丽, 马建海.  四倍体刺槐大小孢子发生和雌雄配子体发育 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 12-17.
    [19] 刘丽, 郝晨, 胡海英, 王莉, 欧阳杰, 孙青, 曲红, 李在留, 金莹, 孙月琴, 王丰俊, 隋金玲, 姚娜, 段旭良, 张玲, 刘美芹, 石娟, 乔海莉, 李莉, 熊丹, 周章义, 贺窑青, 胡晓丹, 雷庆哲, 范丙友, 陈佳, 李艳华, 程堂仁, 郭锐, 陈晓阳, 郑彩霞, 路端正, 田呈明, 骆有庆, 续九如, 张德权, 武彦文, 王建中, 冯菁, 陈发菊, 赵亚美, 周燕, 尹伟伦, 孙爱东, 冯秀兰, 李云, 沈昕, 张香, 尹伟伦, 李凤兰, 康向阳, 骆有庆, 张艳霞, 张志毅, 陆海, 阎伟, 孙爱东, 阎晓磊, 史玲玲, 郑永唐, 骆有庆, 李忠秋, 王百田, 姜金仲, 蒋湘宁, 胡德夫, 马钦彦, 郝俊, 赵蕾, 王晓东, 安新民, 骆有庆, 高述民, 王华芳, 武海卫, 沈繁宜, 卢存福, 梁宏伟, 梁华军, 胡晓丹, 吴晓成, 吴坚, 冯晓峰, 王瑛, 骈瑞琪, 郭晓萍, 邹坤, 温秀凤3, 王华芳, 王冬梅, 崔彬彬
    , 严晓素, 赵兵, 高荣孚, 于京民2, 王建中, 尹伟伦, 王玉兵, 王晓楠, 李凯, 谢磊, 张志翔, 刘玉军, 冯仲科, 王民中, 杨伟光, 张兴杰, 林善枝, 丁霞, 刘玉军, 陈卫平, 孙建华, 沈应柏, 李凤兰, 刘艳, 李镇宇, 陶凤杰, 王玉春, 张庆, 呼晓姝, 蒋平, 赵新丽, 汪植, 马建海, 付瑞海.  诱导大孢子染色体加倍选育白杨杂种三倍体 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 22-25.
    [20] 周志强, 施婷婷, 雷霆, 周国模, 李贤军, 刘志军, 张展羽, 于寒颖, 李国平, 陈伟, 张煜星, 赵俊卉, 刘智, 程金新, 肖化顺, 徐剑琦, 杜官本, 江泽慧, 黄心渊, 曹伟, 雷相东, 王志玲, 崔彬彬, 宗世祥, 程丽莉, 吴家森, 丁立建, 王正, 关德新, 张璧光, 刘童燕, 王海, 张则路, 张贵, 李云, 张彩虹, 雷洪, 黄群策, 杨谦, 李云, 郝雨, 苏淑钗, 苏里坦, 王正, 郭广猛, 曹金珍, 张璧光, 骆有庆, 秦岭, 方群, 刘大鹏, 秦广雍, 李文军, 陈晓光, 黄晓丽, 贺宏奎, 张慧东, 张大红, 姜培坤, 刘彤, 宋南, 吴家兵, 金晓洁], 许志春, 常亮, 张佳蕊, 张书香, 王勇, 周晓燕, 张国华, 于兴华, 蔡学理, 张弥, 高黎, 姜静, 刘建立, 苏晓华, 李延军, 冯慧, 刘海龙, 张金桐, 陈燕, 姜金仲, 朱彩霞, 张冰玉, 尹伟伦, 王德国, 王谦, 周梅, 王安志, 成小芳, 陈绪和, 亢新刚, 金昌杰, 冯大领, 张连生, 聂立水, 陈建伟3, 张勤, 韩士杰, 胡君艳, 崔国发, 梁树军, 姚国龙.  秋水仙碱诱导银杏花粉染色体加倍的研究 . 北京林业大学学报, 2006, 28(6): 15-21.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-05-18
  • 修回日期:  2019-06-04
  • 网络出版日期:  2019-07-03
  • 刊出日期:  2019-07-01

茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
    基金项目:  国家重点研发计划项目(2018YFD1000607)
    作者简介:

    郭烨。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:guoye1630@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物学院

    通讯作者: 李颖岳,博士,教授。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:yingyueli@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S722.3

摘要: 目的离体多倍体育种是枣树育种的重要方法,对其关键技术的研究有利于建立和完善枣树离体多倍体育种体系,加快枣树多倍体种质的创制。方法以茶壶枣无菌叶片为材料,将预培养不同天数(7 ~ 20 d)的叶片固定后制成石蜡切片,进行细胞学观察以确定适宜的预培养时间。在此基础上,将叶片不定芽再生技术与秋水仙素染色体加倍技术相结合,在叶片预培养8、9、10、11 d后,分别用70和90 mg/L的秋水仙素处理48和72 h,并对处理后得到的不定芽进行流式细胞术倍性检测。结果通过对叶片最佳预培养时间的细胞学研究可以得出,茶壶枣无菌叶片在预培养8 ~ 9 d时,分生细胞的分裂能力最强,且未出现分化现象,在此时期用秋水仙素对叶片进行处理,可大大提高诱导率,并且可以有效避免嵌合体和混倍体的出现。染色体加倍试验发现,在预培养8 d后,用70 mg/L的秋水仙素处理72 h,其诱导率最高,达4.11%,并成功获得8株多倍体植株。通过流式细胞术确定这8株多倍体均为纯合四倍体。结论本研究探索出了将茶壶枣叶片不定芽再生体系与秋水仙素染色体加倍技术相结合,人工诱导茶壶枣多倍体的技术方法。

English Abstract

郭烨, 崔艳红, 孔德仓, 曹明, 庞晓明, 李颖岳. 茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
引用本文: 郭烨, 崔艳红, 孔德仓, 曹明, 庞晓明, 李颖岳. 茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
Guo Ye, Cui Yanhong, Kong Decang, Cao Ming, Pang Xiaoming, Li Yingyue. Study on key techniques of polyploid induction in Ziziphus jujuba Mill. cv. ‘Teapot’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
Citation: Guo Ye, Cui Yanhong, Kong Decang, Cao Ming, Pang Xiaoming, Li Yingyue. Study on key techniques of polyploid induction in Ziziphus jujuba Mill. cv. ‘Teapot’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 49-56. doi: 10.13332/j.1000-1522.20190230
  • 枣(Ziziphus jujuba)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus)植物,是我国重要的经济树种 [1]。枣果素以营养丰富著称,是传统中药和滋补保健佳品。研究发现,枣果内不仅含有丰富的糖类、脂肪、蛋白质等物质,还含有人体不可缺少的多种微量元素和维生素[2]。此外,食用枣果还具有免疫调节[3]、抗癌[4] 以及平喘[5] 等功效。杂交育种是果树育种的主要途径,但是大量实践表明,由于枣树花小,去雄和人工授粉操作非常困难,加之枣花量大而坐果率低,存在胚败育现象,难以得到杂种后代,枣树杂交育种非常困难[6-7]。目前,尚未有通过人工杂交获得枣树新品种的报道。

    多倍体现象在植物界中普遍存在,尤其在有花植物中最为普遍[8]。多倍体在很多方面显示出了优越性,其果实较二倍体大,营养成分的含量也显著提高[9]。在枣树人工倍性育种中,石荫坪等[10]最早利用胚乳作为材料,成功获得了金丝小枣、圆铃和长红枣的胚乳三倍体植株。自此,枣树离体加倍技术日渐成熟,已成功利用枣树的茎段[11]、丛生芽[12]、茎尖[13]等材料获得了各品种的多倍体植株。但通过以上材料得到的多倍体多会产生嵌合体和混倍体,其后续的纯化过程十分困难[14]。研究表明,在离体多倍体诱导中采用叶片作为材料,在外植体叶芽原基发生前施加秋水仙素进行处理,然后通过再生体系获得的植株则多为纯合体[15]。Cui等[16]利用叶片不定芽再生技术,用秋水仙素对酸枣无菌叶片进行处理,成功得到了纯合四倍体植株。

    此外,大量研究表明,利用秋水仙素进行离体加倍诱导过程中的预培养时间非常关键。秋水仙素的主要作用是使待处理的外植体有丝分裂同步化,从而改善药剂的作用效果[17]。在有丝分裂过程中,秋水仙素与微管亚基相结合,阻碍了纺锤丝的正常形成,纺锤丝形成的失败使得染色单体不能正常的向两极移动,从而形成了多倍体[18-19]。因此,通过细胞学观察,研究预培养时间与细胞分裂时期的对应关系,准确找到细胞的旺盛分裂期,这对于提高诱导率具有十分关键的作用。

    本研究通过石蜡切片技术对叶片不定芽再生进行细胞学观察,以确定合适的预培养时间。在此基础上设计试验,探索茶壶枣离体加倍处理中秋水仙素浓度、处理时间、预培养时间等关键因素。拟建立茶壶枣离体加倍体系,为枣树的多倍体育种技术的完善和枣树多倍体种质创制提供技术支撑。

    • 茶壶枣因果形酷似茶壶而得名,是兼具食用价值和观赏价值的枣树品种[20]。本文的供试材料茶壶枣组培苗来自本实验室于2014年建立的茶壶枣组培体系[21]。将幼嫩芽苗进行继代培养,30 d后,选取长势良好、叶片嫩绿,生长势相对一致的茶壶枣组培苗作为试验材料。

    • 以茶壶枣无菌叶片为材料,在不定芽启动培养基I(WPM + TDZ 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L)中进行预培养,自叶片预培养第7 d起,每天取样,直至第20 d为止。将预培养不同天数的叶片置于FAA固定液(38%甲醛:冰醋酸:30%乙醇 = 1:1:8)中固定36 h后,采用常规石蜡切片技术[22],利用Olympus-BX 51型光学显微镜,观察茶壶枣叶片在预培养不同天数后叶片内部的细胞学形态,并拍照记录。

    • 选取组培苗形态学自上而下第3 ~ 5枚叶片作为试验材料,沿叶片中脉垂直方向横切2个伤口,切断主脉但不切断叶片,采用两步培养法进行不定芽直接再生。叶片以近轴端接触培养基方式,接种于不定芽启动培养基I上。根据叶片最佳预培养时间的细胞学研究,在避光条件下,将刻伤叶片在不定芽启动培养基I上分别预培养8、9、10、11 d后,将叶片转至含秋水仙素的液体培养基(不含琼脂的不定芽启动培养基I)中分别诱导处理48和72 h。处理结束后,用无菌水清洗叶片4遍,再用无菌滤纸吸干叶片表面液体,继续置于不定芽启动培养基I上进行暗培养,共暗培养21 d后转至不定芽伸长培养基Ⅱ(WPM + IAA 0.1 mg/L + GA 0.5 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 6 g/L)中,置于温度为25 ℃、光照强度2 000 Lx、14 h光/10 h暗的光周期条件下进行培养。

      试验采用完全随机区组试验设计,秋水仙素浓度设为70和90 mg/L两个梯度,处理时间为48和72 h,预培养的时间为8、9、10、11 d。共设16个处理组合(表1),每个处理组合接种3个培养皿,每个皿转接10枚叶片,共3次重复。

      表 1  秋水仙素处理茶壶枣组培苗叶片诱导多倍体处理设计表

      Table 1.  Design table of ‘Teapot’ jujube leaves with colchicine treatments

      处理
      Treatment
      预培养时间
      Pre-culture
      time/d
      秋水仙素浓度
      Colchicine concentration/
      (mg·L− 1)
      秋水仙素处理时间
      Colchicine treatment
      time/h
      1 8 70 48
      2 8 70 72
      3 8 90 48
      4 8 90 72
      5 9 70 48
      6 9 70 72
      7 9 90 48
      8 9 90 72
      9 10 70 48
      10 10 70 72
      11 10 90 48
      12 10 90 72
      13 11 70 48
      14 11 70 72
      15 11 90 48
      16 11 90 72
    • 待叶片再生的不定芽长到1 cm后转入继代培养基(MS + 6-BA 1 mg/L + IBA 0.5 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂5.8 g/L)中伸长生长,每30 d继代一次。待不定芽长到5 cm高时,转入生根培养基(1/2MS + IBA 0.7 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂5.8 g/L)中诱导生根,40 d后,剪取幼嫩叶片用流式细胞仪检测再生植株的倍性。选用二倍体茶壶枣叶片作为对照,荧光通道值设置为50。纵坐标代表检测样品的相对细胞数,横坐标代表荧光通道值,通过峰值的位置可以判定检测样品的倍性。荧光通道值在50左右为二倍体,荧光通道值在100左右为四倍体。

    • 采用Excel 2013 录入和整理数据,并用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析,多重比较采用Duncan氏新复极差法。文中涉及百分比数据需反正弦转换后再进行数据分析。

      四倍体诱导率 = 四倍体株数/不定芽再生数 × 100%

      叶片存活率 = 存活叶片数/处理株数 × 100%

    • 通过试验可以发现,当叶片预培养至第7 d时,由于长时间处于无光照条件下,叶片颜色逐渐从翠绿色转变为黄绿色,而叶片刻伤处未发生明显变化(图1ab)。直到预培养至第11 d时,叶片开始呈现扭曲的状态,切口过主脉处呈现膨大增厚的现象(图1cd)。当进行到第15 d时,切口过主脉处的膨大现象更加明显,并且出现白色的小突起(图1e)。培养至20 d后,切口过主脉处的白色突起达到1 mm,而切口过侧脉处也开始出现白色的突起(图1f)。

      图  1  茶壶枣离体多倍体诱导过程中不同预培养时间的叶片

      Figure 1.  Leaves of different pre-cultivation time during in vitro polyploid induction of ‘Teapot’ jujube

    • 枣叶片主要由叶表皮、亚表皮、维管束及维管束周围大量的薄壁细胞组成[23]。当叶片在不定芽启动培养基I中预培养至7 d时,维管束周围薄壁细胞的细胞核明显,细胞质变浓厚,细胞整体呈变大的趋势,而离维管束较远的薄壁细胞,其状态仍然呈细胞核不明显,细胞质稀疏的状态,这与维管束周围的薄壁细胞已开始进行分裂有关,此外,在维管束的周围开始有少量成团的分生细胞出现(图2a)。当叶片预培养至8 ~ 9 d时,靠近维管束的薄壁细胞继续进行旺盛分裂,而与维管束距离较远的薄壁细胞也开始出现细胞分裂现象(图2bc)。当预培养时间更长,达到10 d以上时,分生细胞的分裂速度急剧增加,并且聚集在一起形成分生组织,逐渐开始分化。从图中可以观察到,构成分生组织的细胞与周围的细胞明显不同,其细胞体积更小,排列更加紧密(图2def)。预培养至13 ~ 14 d时,薄壁细胞继续迅速分裂,分生组织体积变大,并向四周扩展,急速扩张突破外植体,出现芽原基和叶原基。由于叶片表皮细胞和叶肉细胞不具有分裂能力,而逐渐破损脱落(图2gh)。当预培养时间更长,达到20 d时,可从外部观察到,叶片上形成单个或丛生的不定芽(图2i)。

      图  2  茶壶枣叶片不同预培养时间的组织学观察

      Figure 2.  Histological observation on different pre-culture time of ‘Teapot’ jujube leaves

    • 不同浓度的秋水仙素和不同的处理时间对外植体的存活率及不定芽的再生率具有不同程度的影响(表2)。

      表 2  秋水仙素处理对茶壶枣叶片存活率、再生芽数以及四倍体诱导率的影响

      Table 2.  Effects of colchicine treatment on leaf survival rate, number of regenerated buds and tetraploid induction rate in ‘Teapot’ jujube

      处理
      Treatment
      外植体存活率
      Explant survival rate/%
      再生芽数
      Regenerated
      buds
      四倍体诱导率
      Tetraploid induction rate/%
      1 83.33 ± 1.25a 8.40 ± 0.41df 0
      2 69.33 ± 1.46ab 5.60 ± 0.48bcd 4.11
      3 62.33 ± 1.79bc 6.30 ± 0.31df 0
      4 52.00 ± 2.14cde 5.10 ± 0.53a 0
      5 80.60 ± 2.31a 7.98 ± 0.21df 0
      6 62.67 ± 3.21bc 6.21 ± 0.55cdf 1.37
      7 56.67 ± 7.27bcde 6.10 ± 0.54cdf 0
      8 40.67 ± 6.26e 5.40 ± 0.32a 0
      9 70.67 ± 3.73ab 8.40 ± 0.31f 0
      10 59 ± 11.88cdef 6.50 ± 0.81df 0
      11 55.33 ± 4.945bcd 6.30 ± 0.67df 0
      12 45.00 ± 0.91de 5.50 ± 0.62ab 0
      13 79.40 ± 1.57a 7.88 ± 0.29df 0
      14 65.33 ± 7.83bcd 6.45 ± 0.24df 0
      15 60.33 ± 5.51bcd 6.70 ± 0.33df 0
      16 45.23 ± 2.61de 5.70 ± 0.3abc 0
      注:不同的小写字母表示差异显著,P < 0.05。下同。Notes: different lowercase letters indicate a significant difference at P < 0.05 level. The same below.

      总体来看,随着秋水仙素浓度的增加和处理时间的延长,毒害作用加深,使得外植体的存活率和不定芽再生率均呈降低的趋势。

      对外植体存活率的数据进行方差分析(表3)。秋水仙素浓度和处理时间对外植体的存活率和不定芽再生有着极显著的影响(P < 0.01),而预培养时间对外植体的存活率和不定芽再生均没有显著影响。使用浓度为70 mg/L的秋水仙素处理外植体,其存活率极显著高于浓度为90 mg/L的秋水仙素处理结果;而秋水仙素处理48 h外植体后的存活率极显著高于处理72 h后的外植体存活率(图3)。由此,可以得出,随着秋水仙素浓度的增加和处理时间的延长,对外植体的毒害作用逐渐加深,从而造成了外植体存活率的降低。

      图  3  秋水仙素浓度及处理时间对外植体存活率的影响

      Figure 3.  Effects of colchicine concentration and colchicine treatment time on the explant survival rate

      表 3  秋水仙素处理茶壶枣叶片外植体存活率的方差分析

      Table 3.  Variance analysis of explant survival rate on colchicines treatment of ‘Teapot’ jujube

      变异来源 Source of variation自由度 Degree of freedom (df)均方 Mean square (MS)F
      预处理时间 Pre-culture time 3 102.702 2.498
      秋水仙素浓度 Colchicine concentration 1 2 238.692 54.443**
      秋水仙素处理时间 Colchicine treatment time 1 1 279.600 31.119**
      随机误差 Random error 31 41.120
      总计 Total 36
      注:**表示达到极显著差异,P < 0.01。下同。Notes: ** indicates extremely significant difference at P < 0.01 level. The same below.

      对不定芽再生数的数据进行方差分析(表4)。秋水仙素浓度和处理时间同样对不定芽再生数有极显著影响(P < 0.01)。秋水仙素浓度越大,处理时间越长,不定芽再生数越少。但在试验过程中对叶片外植体进行观察,发现秋水仙素处理后可存活的外植体均可分化出不定芽。使用浓度为70 mg/L的秋水仙素处理外植体,其不定芽再生数极显著高于浓度为90 mg/L的秋水仙素处理后结果;秋水仙素处理48 h后外植体的不定芽再生数极显著高于处理72 h后的外植体不定芽再生数(图4)。此结果,同样与秋水仙素毒害作用的累加有关。

      图  4  秋水仙素浓度及处理时间对不定芽再生数的影响

      Figure 4.  Effects of colchicine concentration and colchicine treatment time on the number of adventitious bud regeneration

      表 4  秋水仙素处理茶壶枣叶片外植体再生芽数的方差分析

      Table 4.  Variance analysis of explant survival rate on colchicine treatment of ‘Teapot’ jujube

      变异来源 Source of variation自由度 Degree of freedom (df)均方 Mean square (MS)F
      预处理时期 Pre-culture time 3 0.318 0.527
      秋水仙素浓度 Colchicine concentration 1 20.358 20.358**
      秋水仙素处理时间 Colchicine treatment time 1 24.225 40.111**
      随机误差 Random error 32 0.645
      总计 Total 37
    • 从叶片外植体上剪取长度在1 cm左右的不定芽,将其转接到茶壶枣继代培养基中,培养30 d后,对其进行生根培养,共获得健壮的再生植株146棵。取生根后的再生植株的叶片进行流式细胞仪检测。通过检测,共测得四倍体茶壶枣8株,未发现嵌合体和混倍体,其余均为二倍体(图5)。四倍体分别出现在2号和6号处理中,即将茶壶枣离体叶片先进行8 d或9 d预培养,再用浓度为70 mg/L的秋水仙素进行诱导处理,处理时间为72 h。

      图  5  流式细胞仪倍性分析图

      Figure 5.  Analysis diagram of ploidy by FCM

    • 对外植体进行预培养的目的是使诱导材料处于同一分裂期[17]。由于秋水仙素只对处于分裂期的细胞有作用,因此找到适宜的处理时期是提高多倍体诱导率,降低或避免嵌合体和混倍体出现的关键[24]。Ma等[25]通过组织学研究发现,在灰枣不定芽再生过程中,暗培养进行至一半时,细胞核开始启动分裂,由此推测此时可能为秋水仙素处理的最佳时期。此外,研究发现,不同枣品种、不同外植体所需要的预培养时间不同。王娜[12]研究发现以冬枣、酸枣的茎段和丛生芽为外植体进行诱导时,最佳预培养时间为4 d;宁强[14]以冬枣和辣椒枣的叶片为外植体进行离体诱导的最佳预培养时间为10 d。在本研究中,为了确定最佳处理时期,对茶壶枣不同预培养时间的叶片进行了细胞学研究。研究发现,预培养 8 ~ 9 d时维管束附近的薄壁细胞已经启动分化,且一部分已经分化形成分生组织,此时处于分裂期的细胞最多,且分生组织还未分化形成芽原基和不定芽。这一发育过程与Ma等[25]对灰枣不定芽再生的研究结果一致。在此时期对叶片进行秋水仙素处理,其诱导率最高。预培养时间越短,薄壁细胞分裂形成的分生细胞越少,秋水仙素处理后得到的多倍体细胞较少,发育成完整植株的可能性越低,诱导率随之降低;若预培养时间过长,分生组织开始分化形成芽原基和不定芽,此时细胞分裂虽然也很旺盛,但容易形成嵌合体和混合体,造成后期纯化困难[26]。同时,在本研究中,经过秋水仙素诱导得到多倍体的处理也都是在预培养8 ~ 9 d的条件下获得的,与组织切片研究的结果一致。

    • 在枣树离体加倍过程中,秋水仙素浓度和处理时间都直接影响外植体的再生率和多倍体的诱导率[27-28]。秋水仙素对诱导材料有毒害作用,一般来说秋水仙素浓度越高,对外植体的毒害越大,死亡率越高,再生率越低,但多倍体的诱导率会相应提高;相反,秋水仙素浓度低,外植体的死亡率降低,再生率提高,但诱导率会下降[29-30]。研究发现,不同的枣树品种、不同的处理材料适宜的秋水仙素浓度和处理时间均不同[31-32]。Gu等[13]研究发现沾化冬枣芽尖的最适秋水仙素浓度为90 mg/L,处理时间为48 h;枣组培苗茎段的最适浓度和处理时间分别为50 mg/L,处理72 h和100 mg/L,处理48 h;枣愈伤组织的最适浓度为50 mg/L,处理24 h。王岩[33]经研究发现,酸枣叶片的最适秋水仙素浓度为60 ~ 80 mg/L,处理时间为48 ~ 72 h。而本文经研究得出,茶壶枣的最适秋水仙素浓度为70 mg/L,处理时间为72 h。

      本试验以茶壶枣无菌叶片为材料,借助石蜡切片技术确定最佳预培养时间,将叶片不定芽再生技术与秋水仙素染色体加倍技术相结合,成功得到茶壶枣纯合四倍体植株,为枣树的多倍体育种技术体系的建立和完善以及枣树多倍体种质的大量创制奠定了基础,同时也为枣树遗传转化研究提供了坚实的理论依据。

参考文献 (33)

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