云南金钱槭(Dipteronia dyerana)是隶属于槭树科(Aceraceae)金钱槭属的一种落叶乔木，仅分布于云南东南部及贵州西南部海拔2 000~2 500 m的疏林中，为国家Ⅱ级珍惜濒危保护植物^[1]。长期以来，云南金钱槭的种级系统位置界定，主要依据其独特的形态学特征(翅果成圆环形等)，并与金钱槭(Dipteronia sinensis)共同组成我国特有属——金钱槭属。

金钱槭属作为槭属(Acer)的姐妹属，常作为槭属等相关研究的外类群，但它常常不能形成单系群或属内物种嵌于槭属中。Tian等^[2]采用ITS和trnL-F片段对槭属进行系统学研究中，云南金钱槭内嵌于槭属，导致金钱槭属没有形成单系群；Pfosser等^[3]在关于亚洲槭属物种的亲缘关系重建中，金钱槭内嵌于槭属之内，导致金钱槭属在分析中不能作为外群；Grimm等^[4]使用ITS片段，利用最大似然法构建槭属系统发育树时，云南金钱槭出现在槭属内部；Li等^[5]研究发现，在最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建系统树时，金钱槭属的物种不能形成单系群。此外，相对早期的研究也存在类似情况^[6-7]。Yang等^[8]虽对此进行了讨论，但目标基因片段选择相对较少，且对于槭属属内分类组的辅助研究材料选择较为局限。因此，对云南金钱槭在其近缘物种中进行系统位置的确定研究，具有重要的理论与实践意义。

近年来，在物种系统位置相关分析中，基因片段的选择多集中于核ITS片段以及叶绿体trnL-trnF、rbcL、rpl16等片段^[9-15]。此外，在金钱槭属及槭属的研究中，也常使用叶绿体psbM-trnD、trnD-trnT片段^[5]以及psbA-trnH片段等(未发表数据)。因此，本研究选取8个基因片段，包括6个叶绿体基因片段(psbM-trnD、rbcL、trnD-trnT、rpl16、trnL-trnF和psbA-trnH)与2个核基因片段(ITS与CHS)，研究金钱槭属及其近缘属(槭属)的系统发育关系。通过多基因组合系统学分析，尝试理清云南金钱槭的系统位置及其与近缘类群的系统关系，并为其姐妹属(例如：槭属、七叶树属、掌叶木属等)的研究提供帮助。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

本研究以云南金钱槭为材料，并在槭树属内14个分类组中^[16]，每组各选取一个物种作为辅助材料(其中psbM-trnD、trnD-trnT与CHS选取不足14个)(表 1)。此外，七叶树属(Aesculus)作外群。叶绿体基因psbM-trnD、rbcL、trnD-trnT片段与核基因ITS片段序列全部选自GenBank，叶绿体基因rpl16、trnL-trnF与psbA-trnH片段大部分为本实验所得，核基因CHS片段全部为本实验所得(表 1)。每个实验物种采集其幼嫩叶片，分别放入置有变色硅胶的取样袋中干燥、备用。同时，压制凭证标本经由北京林业大学博士生高健鉴定并存放于北京林业大学林学院。

表  1  试验材料及其序列号

Table  1.  Species used in this study and their GenBank accession numbers

属 Genera	组 Section	来源 Source	编号 Code	采集者 Collector	种 Species	序列登录号GenBank accession No.
						ITS	CHS	psbM- trnD	rbcL	trnD- trnT	rpl16	trnH-PsbA	trnL-F
七叶树属 Aesculus		青秀山，南宁Qingxiu Mountain, Nanning	k028	陆志成 LU Zhi-cheng	A. wangii	AF406968	KX000286*
		NCBI			A. glabra			DQ659840		AY968623
		NCBI			A. flava				DQ978441	AY968613	DQ978509	DQ978642	DQ978573
		NCBI			A. parviflora				DQ978448		DQ978510	DQ978643	DQ978574
		上海植物园，上海Shanghai Botanical Garden, Shanghai	i008	杜宝明 DU Bao-ming	A. chinensis		KX000285*
金钱槭属 Diteronia		堵河源保护区，十堰 Duheyuan National Nature Reserve, Shiyan	y010	郑德国 ZHENG De-guo	D. dyerana	DQ238333	KX000287*	DQ659838	DQ978443	DQ659778	DQ978512	DQ978645	DQ978576
		青秀山，南宁Qingxiu Mountain, Nanning	k029b	陆志成 LU Zhi-cheng	D. sinensis	AY605290	KX000288*	DQ659839	DQ978444	DQ659779	KU500460*	KU500519*	KU522513*
槭属 Acer	尖齿枫组 sect. Arguta	安图县，延边Antu County, Yanbian	q004	刘琪璟 LIU Qi-jing	A. barbinerve	AJ634569	KX000274*		DQ978395		KU500434*	KU500513*	KU522490*
		NCBI			A. acuminatum			DQ659841		DQ659781
	全缘叶枫组 sect. Oblonga	上海植物园，上海 Shanghai Botanical Garden, Shanghai	i002	杜宝明 DU Bao-ming	A. buergerianum	AY605466	KX000275*	DQ659843		DQ659783	KU500435*	KU500514*	KU522491*
		NCBI			A. buergerianum var. formosanum				DQ978396
	枫组sect. Acer	NCBI			A. caesium subsp. giraldii	AY605295		DQ659893	DQ978397	DQ659833	DQ978453	DQ978584	DQ978519
	穗状枫组 sect. Spicata	NCBI			A. caudatum subsp. multiserratum	AY605432			DQ978401
		华南植物园，广州South China Botanical Garden, Guangzhou	d005	简曙光 lJIAN Shu-guang	A. caudatum		KX000276*	DQ659887		DQ659827	KU500444*	KU500509*	KU522508*
	大花枫组 sect. Macrantha	NCBI			A. davidii subsp. davidii	AY605392			DQ978406
		浙江农林大学，临安 Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an	o001	陈秋夏 CHEN Qiu-xia	A. davidii		KX000277*	DQ659848		DQ659788
		浙江农林大学，临安 Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin'an	o006	陈秋夏 CHEN Qiu-xia	A. davidii subsp. grosseri						KU500459*	KU500550*	KU522512*
	鸡爪枫组 sect. Palmata	NCBI			A. palmatum subsp. palmatum	AY605425
		中科院植物所，北京 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing	b015	廖培钧 LIAO Pei-jun	A. palmatum		KX000280*	DQ659867	DQ978421	DQ659807	KU500472*	KU500503*	KU522530*
	三小叶枫组 sect. Trifoliata	堵河源保护区，十堰 Duheyuan National Nature Reserve, Shiyan	y005	郑德国 ZHENG De-guo	A. griseum	AY605467	KX000278*	DQ659857	DQ978411	DQ659797	KU500463*	KU500530*	KU522514*
	扁果枫组 sect. Hyptiocarpa	NCBI			A. laurinum	AM113541			DQ978413	DQ659794	DQ978473	DQ978604	DQ978536
	复叶枫组 sect. Negundo	华南植物园，广州South China Botanical Garden, Guangzhou	d001a	简曙光 JIAN Shu-guang	A. negundo	AY605406	KX000279*	DQ659864	DQ978417	DQ659804	KU500471*	KU500535*	KU522527*
	五小叶枫组 sect. Pentaphtlla	茂县，阿坝藏族羌族自治州Maoxian County, Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture	u003	包维楷 BAO Wei-kai	A. pentaphyllum	DQ238478	KX000281*	DQ659870	DQ978422	DQ659810	KU500474*	KU500538*	KU522534*
	疏毛枫组sect. Pubescentia	中科院植物所，北京Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing	b013	廖培钧 LIAO Pei-jun	A. pilosum	DQ238345			DQ978423		KU500491*	KU500546*	KU522535*
		NCBI			A. pilosum var. stenolobum		KX000282*
	桐状枫组sect. Platanoidea	黑龙江森林植物园，哈尔滨Heilongjiang Forest Botanical Garden, Harbin	h004	毛子军 MAO Zi-jun	A. pictum subsp. mono	LK022665					KU500431*	KU500534*	KU522525*
		NCBI			A. pictum subsp. pictum				AB872557
	茶条枫组 sect. Ginnala	黑龙江森林植物园，哈尔滨Heilongjiang Forest Botanical Garden, Harbin	h002	毛子军 MAO Zi-jun	A. tataricum subsp. ginnala	AY605363	KX000284*	DQ659855	DQ978436	DQ659795	KU500479*	KU500521*	KU522544*
		NCBI			A. sterculiaceum subsp. franchetii	DQ366145			DQ978435
	坚果枫组 sect. Lithocarpa	紫金山，南京Zijin Mountain, Nanjing	m008	葛之葳 GE Zhi-wei	A. sinopurpurascens		KX000283*	DQ659878		DQ659818	KU500490*	KU500545*	KU522538*
注:*代表本研究中获得的序列。Notes: * represents sequences obtained in present study; NCBI, National Center for Biotechnology Information.

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1.2   DNA提取、聚合酶链式反应(PCR)及测序

每份样品取约0.2 g干燥叶片，采用植物基因组DNA小型提取试剂盒(Plant Genomic DNA kit)基因组DNA。叶绿体基因组片段rpl16、trnL-trnF、psbA-trnH和核基因组片段CHS的PCR扩增均在Labnet MultiGene^TM 96-well Gradient Thermal Cycler上完成。PCR反应体系为20 μL，主要包含DNA模板10 ~ 30 ng、50 mmol/L Tris-HCl、1.5 mmol/L MgCl₂、1 mmol/L dNTPs、各0.3 μL的正反引物、0.2 U Taq DNA聚合酶(博尔纳德股份有限公司，台湾)。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52~58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往台湾基龙米克斯生物科技股份有限公司并在ABI3730XL遗传分析仪上进行测序。

1.3   数据分析

利用Bioedit 7.1.11软件^[17]对获得的基因组片段序列进行整理、拼接以及校正，将经手工矫正后的各基因组片段的序列提交至GenBank，其登录号见表 1。采用MP法与贝叶斯法(BI)分别构建8个单独基因以及6个叶绿体联合基因的系统发育关系。PAUP 4.0b10软件进行MP法分析时，空位(Gap)作为缺失状态，采用启发式搜索(Heuristic search)进行1 000次随机加入，以TBR(tree-bisection-reconnection)进行枝长交换，得到的系统树分枝的可靠性评价使用自展分析(bootstrap, BS)。BI法分析使用MrBayes ver.3.2，利用Modeltest ver.2.2进行模型和参数估计，选择最适碱基替代模型。贝叶斯推断以随机树(random tree)开始分析，2条马尔可夫链(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)同时运行，温度参数值设为0.2，共运行1 000 000代，每100代保留1棵树。前25%代作为动态老化样本(burn-in samples)被舍弃，仅对剩余的静态抽样计算一致性树(consensus tree)并计算相关参数，一致性树上的各分支可信度评价用后验概率(posterior probability, PP)表示。

2.   结果与分析

2.1   6个叶绿体基因单独及联合数据分析

在6个叶绿体基因单独分析中，云南金钱槭与其属内姐妹种金钱槭形成单系群的有rbcL(BS=87%，PP=100%)与rpl16(BS=90%，PP=98%)片段；psbA-trnH、trnD-trnT与trnL-trnF片段能把金钱槭属与槭属植物很好分开，但不支持属内两个物种形成单系群；而psbM-trnD片段的结果显示金钱槭属与槭属混在一起，形成并系群。

在6个叶绿体基因联合分析中，覆盖云南金钱槭、金钱槭、槭树属内11个分类组以及外群七叶树属。七叶树属以及部分槭树属内分类组物种的基因片段来源于同一属及同一组的不同物种(表 1)。其中Aesculus flara缺psbM-trnD片段由Aesculus glabra的psbM-trnD片段代替，来象征七叶树属；尖齿枫组中Acer barbinerve缺psbM-trnD与trnD-trnT片段由Acer acuminatum的psbM-trnD与trnD-trnT片段代替，来象征尖齿枫组(Acer sect. Arguta)；坚果枫组中Acer sinopurpurascens缺rbcL片段由Acer sterculiaceum subsp. franchetii的rbcL片段代替，来象征坚果枫组(Acer sect. Lithocarpa)，此外，扁果枫组(Acer sect. Hyptiocarpa)、疏毛枫组(Acer sect. Pubescentia)、桐状枫组(Acer sect. Platanoidea)因序列不全，不列入6个叶绿体基因联合分析中。6个叶绿体基因联合矩阵的序列总长度为4 860 bp，变异位点为685个，其中信息位点为97个。联合数据的最优进化模型为GTR+G。最大简约法分析得出1棵最简约树，树长为913，一致性指数(consistency index)为0.863 1，保持性指数(retension index)为0.362 2。在叶绿体基因联合最简约树中(图 1)，槭属物种(BS = 99%，PP = 100%)被强烈支持形成单系群，而金钱槭属物种虽也被认为是单系群，但其支持度相对较低(BS = 52%，PP = 89%)。此外，金钱槭属与槭属被强烈支持为姐妹属(BS = 100%，PP = 100%)。最大简约法与贝叶斯分析结果显示，两种分析方法所构建的系统树拓扑结构较为一致，在自展支持率上，贝叶斯分析略高于最大简约法。

图  1  基于叶绿体基因合并序列分析构建的最大简约树

菱形◆表示云南金钱槭的系统位置。分支上部数值表示MP分析的抽样自展值(≥50%), 分支下部数值是贝叶斯分析的后验概率值(≥50%)。以下各图同此。

Figure  1.  Single most parsimonious tree generated from combined chloroplast data

◆ represents the phylogenetic status of D. dyeriana. Values at nodes indicate bootstrap support under maximum likelihood and parsimony. Bootstrap values (≥50%) are shown above the branches, and Bayesian posterior values (≥50%) are indicated below the branches. The same as below.

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2.2   CHS序列分析

CHS序列分析中涵盖了云南金钱槭、金钱槭、槭树属内11个物种(分别代表 11个组)及2个七叶树属物种(表 1)。CHS矩阵的序列总长度为526 bp, 变异位点为78个，其中信息位点为64个。数据的最优进化模型为HKY+G。最大简约法分析得出1棵最简约树，树长为114，一致性指数(CI)为0.736 8，保持性指数(RI)为0.687 5。在CHS序列数据分析中(图 2)，云南金钱槭与其姐妹种金钱槭形成高支持度的单系群(BS = 99%，PP = 99%)，但与6个叶绿体基因分析结果不同，金钱槭属与槭树属间关系较为模糊。

图  2  基于CHS序列分析构建的最大简约树

Figure  2.  Single most parsimonious tree generated from CHS data

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2.3   ITS序列分析

ITS序列分析中涵盖了云南金钱槭、金钱槭、槭树属内14个物种(分别代表 14个组)及1个七叶树属物种(表 1)。ITS矩阵的序列总长度为559 bp，变异位点为178个，其中信息位点为81个。联合数据的最优进化模型为GTR+G。最大简约法分析得出1棵最简约树，树长为415，一致性指数(CI)为0.566 3，保持性指数(RI)为0.174 3。在ITS序列数据分析中(图 3)，金钱槭属物种与槭属物种混在一起，为并系群。其中，云南金钱槭内嵌于槭属内部，与梣叶槭(Acer negundo)聚合在系统树的末端。

图  3  基于ITS序列分析构建的最大简约树

Figure  3.  Single most parsimonious tree generated from ITS data

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3.   讨论与结论

方文培^[1]、Xu等^[16]根据云南金钱槭冬芽裸露，叶系为羽状复叶(7 ~ 15小叶)以及果实具有圆形翅等特征，与具有类似形态的金钱槭一并归入金钱槭属。而以上的形态差异也正是金钱槭属与槭属主要的形态分类依据。在以往关于槭属的系统学研究中，出现过多次云南金钱槭的系统位置内嵌于槭属内部的现象^{[2, 4-5]}。更有甚者，因金钱槭属物种不能与槭属物种区分，从而把2个属作为一个整体进行讨论^[3]。在本研究中，通过叶绿体基因组合、CHS片段和ITS片段的分析显示，的确存在云南金钱槭系统位置不一致的现象。在6个叶绿体基因组合构建的系统发育树中，云南金钱槭与金钱槭形成单系群，且金钱槭属与槭属互为姐妹属(BS = 100%, PP = 100%)(图 1)，此结果支持Renner等^[18]基于叶绿体基因构建的系统发育树。值得注意的是，以往基于叶绿体基因的研究中，曾出现过金钱槭属内物种内嵌于槭属内部^[2-3]以及金钱槭属与槭属之间形成并系群的状况^[5]，但这类状况多出现在基于少量叶绿体基因的研究结果(单个或两个)。而在本研究中增加叶绿体基因数量之后，云南金钱槭所在的金钱槭属与槭属之间被高度支持为姐妹属(图 1)。所以，从基于叶绿体基因遗传分析的角度来讲，支持前人形态分类学^{[1, 16]}的结果。

相较于母系遗传的叶绿体基因，双亲遗传的核基因可能蕴含着更加丰富的系统发育信息^[19]。在CHS基因构建的系统发育树中，云南金钱槭所在的金钱槭属为单系群并被强烈支持(BS=99%, PP=99%)，但与槭属间的亲缘关系并不明确(图 2)。而且，核CHS基因对于槭属属内物种间亲缘关系的解析力较差(图 2)。这可能是由于核CHS基因缺乏足够的变异信息位点所导致。而在核ITS基因构建的系统发育树中，云南金钱槭的系统位置位于槭属内部(图 3)，此前也有类似的研究结果^{[4, 8]}。由于核基因相较于叶绿体基因具有较快的进化速率^[20]，以及金钱槭属与槭属的分化时间约为62百万年前^[18]。所以，在核ITS基因中，云南金钱槭与槭属物种可能因长时间的适应性进化导致序列出现趋同，而单亲遗传的叶绿体基因的变异相对保守，反应出较为原始的系统关系。需要指出的是，核ITS基因存在多拷贝的情况，况且槭树科的物种间杂交较为常见^[3]，协同进化的时间可能不足以使多个拷贝变为相同的基因型。所以，克隆挑选出直系同源拷贝进行系统发育重建可能是下一步的研究方向。

综上所述，6个叶绿体基因组合与核CHS基因的序列分析结果，均支持云南金钱槭所在的金钱槭属为单系群，并且6个叶绿体基因组合高度支持金钱槭属与槭属互为姐妹属。核ITS基因虽然支持云南金钱槭归入槭属之内，但多拷贝的问题值得注意。结合形态学证据，尤其是云南金钱槭与槭属植物翅果形状的明显差异^{[1, 16]}，建议云南金钱槭的系统位置继续放在金钱槭属之内。此外，完善槭属物种的采样种类以及增加实验所选择的基因数量，将有助于进一步准确界定云南金钱槭的系统位置。

致谢  感谢台湾师范大学廖培钧副教授、黄秉宏博士和内蒙古大学柴诗瑶老师对论文初稿的修改。