Genetic diversity of germplasm resources of Leuce based on SSR fluorescent marker
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摘要:目的进行白杨派种质资源的遗传多样性研究，为毛白杨种质资源保存、评价与利用提供参考。方法对所收集的白杨派无性系采用毛细管电泳法进行荧光SSR-PCR产物检测，利用所得结果评价种源及无性系间的遗传变异和遗传多样性水平。结果16对SSR引物对272个无性系进行检测，共检测到106个等位基因，每位点的等位基因数为4~11个，平均等位基因数为6.625个；平均观测杂合度(Ho)值为0.561，平均期望杂合度(He)值为0.432，表明遗传多样性比较丰富；有9个位点的Ho/He大于1，表明杂合度比较高。对其中来自毛白杨6个集中分布区的234个无性系进行遗传变异分析，结果表明：2%的遗传变异来源于种源间，98%的遗传变异来自于种源内无性系间；由不同种源间的等位基因模型可知，山西、陕西、河南、山东和河北5个种源的无性系均有特有等位基因，杂交时可以适当选择不同种源的无性系作杂交亲本以拓宽杂交种的遗传基础，或种源间适当引种增加毛白杨种源间的遗传多样性。结论聚类分析和主坐标分析结果均表明，北京与河北种源亲缘关系最近，河南与陕西、山东与山西亲缘关系也较近，分别聚为3大类群，而相同种源的无性系并没有完全聚到一类，其原因可能是由于种源间相互引种或遗传变异造成的。研究结论为毛白杨种质资源保存和利用提供了理论依据。Abstract:ObjectiveGenetic diversity of germplasm resources of Leuce was studied to provide reference for the preservation, evaluation and utilization of the germplasm resources of Poplus tomentosa.MethodIn this study, capillary electrophoresis with fluorescent-labeled primers was used to analyze clones in Leuce, and genetic diversity and genetic variation were analyzed based on the results.ResultA total of 106 alleles were detected in 272 clones using 16 pairs of SSR primers. The number of alleles per locus ranged from 4 to 11, with an average of 6.625 each loci, the average Ho and He were 0.561 and 0.432, respectively, indicating that the genetic diversity was relatively abundant, and the ratio of Ho to He for 9 loci was greater than 1, indicating the high heterozygosity. In addition, the genetic variation of 234 clones from six concentrated areas of Populus tomentosa was analyzed. The results showed that only 2% of the genetic variation originated among provenances, and 98% within provenances. It could be got to know from the allelic models of different provenances that there were private alleles in five provenances of Shanxi Province, Shaanxi Province, Henan Province, Shandong Province and Hebei Province.Clones with private alleles from different provenances should be selected as parents to broaden the genetic basis of hybrids, or introduced appropriatly to increase the genetic diversity of P. tomentosa among provenances.ConclusionCluster analysis and principal coordinate analysis showed that the phylogenetic relationship of Beijing and Hebei clones was the closest, and the relationship between Henan and Shanxi, Shandong and Shanxi was closer, respectively. However, clones from the same provenance weren't converged fully one category, owing to genetic variation or the mutual introduction of the provenances. The results provided theoretical basis for the preservation and utilization of germplasm resources of P. tomentosa.
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Keywords:
- fluorescent SSR marker /
- Populus tomentosa /
- germplasm resources /
- genetic diversity
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白杨派(Leuce)是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)中重要派别，其具有速生、优质、抗逆等优良特点，在我国北方林业生产和生态环境建设中占有重要地位，已被广泛应用于城乡绿化、农田防护林及速生丰产林中[1-4]。由于白杨派内不同种及杂种间存在着广泛的形态变异以及杂交渐渗，导致派内系统发育及进化相关问题一直没有完全解决[5]，其中毛白杨的起源问题一直存在争议，因此进行白杨派种质资源的遗传多样性研究有助于白杨派系统发育重建、种质资源评价、新品种选育等工作的进一步开展[6-7]。
随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，不同类型的的DNA分子标记技术可直接对植物的遗传多样性进行研究，已广泛应用于不同植物的遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位等研究领域[8-12]。在我国，有不少学者用不同类型标记对白杨派种质资源进行了遗传多样性及遗传变异分析[13-16]，而利用荧光SSR标记开展白杨派种质资源遗传多样性研究尚未见报道。
为了进一步探明目前我国白杨派部分种质资源的遗传多样性，本研究选取272份种质为试验材料，采用SSR荧光标记技术评价种源及无性系间的遗传变异和遗传多样性水平，研究结论为白杨派种质资源保存和利用提供理论依据，同时为毛白杨引种、选择育种及杂交亲本选配奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料来自山东省国有冠县苗圃的全国毛白杨基因库，基因库于2009年建立，共保存了340个无性系，分别来自北京、河北、山东、河南、山西、陕西等9个毛白杨分布区，每个无性系栽植6株，株行距3m×6m。
以省市作为种源，采用随机取样原则。种源内无性系数量少于30者全部取样，大于30者按50%的入选率取样[14]，共选取了9个毛白杨种源、部分白杨杂种及新疆杨在内的272个无性系作为研究对象。各种源取样数及无性系编号见表 1。
表 1 不同种源取样数及无性系编号Table 1. Number of samples from different provenances and clone No.来源
Source样本数
Sample number无性系编号
Clone No.北京Beijing 25 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 河北Hebei Province 56 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 山东Shandong Province 19 82, 83, 221, 222, 232, 234, 235, 237, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 254, 255 河南Henan Province 41 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 223, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 257, 258, 259 山西Shanxi Province 44 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 260 陕西Shaanxi Province 49 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 238, 239, 261 甘肃Gansu Province 5 204, 205, 206, 207, 208 安徽Anhui Province 9 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217 江苏Jiangsu Province 4 218, 219, 220, 263 白杨杂种White poplar hybrid
(WPH)19 224, 231, 233, 236, 240, 241, 250, 252, 253, 256, 262, 264, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272 新疆杨P. bolleana 1 265 1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA提取
所用材料的DNA均采用英芮诚生化科技(上海)有限公司植物组织基因组DNA提取试剂盒(磁珠法)[17]，步骤参照说明书。
1.2.2 引物来源
所用引物共有16对，由北京林业大学林木育种国家工程实验室提供[18]，详情见表 2。
表 2 引物序列信息Table 2. Primer sequence informationSSR编码
SSR code重复单元
Repeat motifSSR位置
Position of SSR正向引物序列
LP sequence反相引物序列
RP sequencePtr_1_SSR1 [CCT]5 61857~61870 AAAGCTTGTGTTCCACTTGT CAGATCTACCTCCTCCATCA Ptr_1_SSR2 [AAGA]6 98103~98127 TCTCAATTACATCCCAATCC GGTTGATTCACCAGCAGTAT Ptr_3_SSR13 [TA]10 12067876~12067894 AGTTGTTTGGGCTGTGTATC GTGCAATTCCCTGATTTAAG Ptr_7_SSR14 [ATT]6 1689228~1689246 TCCCACAAGCACTCTTAACT CCTTTGCAGCACAGTAGTAA Ptr_7_SSR15 [TG]12 1788775~1788798 CACTTGCTCTTACTCCTGCT CCAGGACAAATGCAATACTT Ptr_9_SSR3 [CGA]7 464617~464636 TCGAATTCTCCGATAGTGTT AATGCTTTCTTATGCTGCTC Ptr_10_SSR1 [GAC]9 364056~364082 CCAACAACAAGTACCCTCAT AGCTAGAGTCCTGTCTGCTG Ptr_11_SSR1 [TA]29 32355~32412 TGAATGAAATACATTGCTGC GCTATTATTGGATTTGCCTG Ptr_11_SSR8 [AT]30 3040852~3040911 AAATGGAGACTTGTGTGGAC GTGCAATAAAGCAGTGTGAA Ptr_13_SSR6 [GAA]8 732759~732781 TGGTACTCTCCTCTTGCCTA CCTTCAGTTTCTGCTTCATC Ptr_14_SSR7 [GCG]6 714903~714919 TGATTCTACTGGATCCAACC TATCCGATTCTCTAAGGCAA Ptr_14_SSR11 [TCC]8 1130007~1130029 CTCTCAGTTCTCTTGGATCG GAGGTCTCATTTGTTGAAGC Ptr_14_SSR12 [AT]13 1300753~1300777 TACTGGTGGTGCTCAATACA AAAGCAAACGCAGTAATAGC Ptr_16_SSR3 [AT]10 567670~567689 GGGATTTCACCACTTATTGA TTATATTTGTCTGGGAGCGT Ptr_18_SSR17 [AT]13 6997967~6997992 TTTCTGATGCTGTAGCTGTG ATCAGTATGCTTTGCCTGTT Ptr_19_SSR1 [TCA]8 110734~110756 ATTTCTTTCGCCTCATAACA CCCTCTTTGTGTGGAATTTA 1.2.3 荧光引物PCR扩增与PCR产物毛细管电泳检测
荧光引物由北京市睿博兴科生物技术有限公司合成，纯化方式PAGE。
PCR选用20μL体系：DNA(20ng/μL)0.5μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，正反引物各0.15μL，灭菌去离子水补足20μL。
荧光引物PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
毛细管电泳检测：4种PCR产物各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。
1.3 统计分析
采用Genemarker 2.2.0软件进行毛细管电泳数据分析，使用popgene软件计算各遗传多样性指数，通过Ward法(Ward’s method)构建272个无性系的进化树，进而分析无性系间的亲缘关系。
2. 结果与分析
2.1 不同位点的遗传多样性分析
表 3列出了不同位点的遗传多样性指标，16对SSR引物对白杨派的272个样本共扩增出106个等位基因，每位点的等位基因数为4~11个，平均每对引物扩增出6.625个等位基因，最多的是Ptr_18_SSR17有11个等位基因，最少的是Ptr_19_SSR1位点，只有4个等位基因。实际观察杂合度(Ho)变化范围较大，在0.015~0.993之间，平均Ho值为0.561；而平均期望杂合度(He)值为0.432，介于0.033~0.678之间，表明遗传多样性中度丰富。位点Ptr-1-SSR2、Ptr-7-SSR14、Ptr_11_SSR1、Ptr_10_SSR1、Ptr_14_SSR12、Ptr_14_SSR7、Ptr_14_SSR11、Ptr_7_SSR15和Ptr_13_SSR6共9个位点的Ho/He大于1，表明这些位点的杂合度比较高。以上遗传多样性参数表明272份白杨派无性系具有较高的遗传多样性。
表 3 16个位点272个白杨派样品SSR引物多态性分析Table 3. Polymorphism analysis of 272 clones of Leuce at 16 SSR locus位点
Locus样本量
Sample number等位基因数
Allele number有效等位基因数
Effective number of alleleShannon信息指数
Shannon information index观测杂合度
Observed heterozygosity(Ho)期望杂合度
Expected heterozygosity(He)多态信息指数
Polymorphic information indexPtr-1-SSR2 272 5.000 2.236 0.898 0.952 0.553 0.388 Ptr-7-SSR14 272 9.000 3.992 1.573 0.897 0.750 0.691 Ptr-1-SSR1 272 5.000 1.840 0.837 0.287 0.456 0.423 Ptr_9_SSR3 272 5.000 1.098 0.238 0.022 0.089 0.021 Ptr_11_SSR1 272 7.000 2.604 1.134 0.923 0.616 0.494 Ptr_10_SSR1 272 6.000 2.390 1.000 0.982 0.582 0.597 Ptr_11_SSR8 272 5.000 1.038 0.113 0.018 0.036 0.004 Ptr_14_SSR12 272 9.000 2.060 1.058 0.599 0.515 0.429 Ptr_14_SSR7 272 5.000 2.054 1.033 0.537 0.513 0.461 Ptr_16_SSR3 272 6.000 1.034 0.109 0.015 0.033 0.000 Ptr_3_SSR13 272 7.000 1.463 0.583 0.279 0.316 0.224 Ptr_14_SSR11 272 6.000 2.088 0.812 0.978 0.521 0.378 Ptr_18_SSR17 272 11.000 3.103 1.446 0.482 0.678 0.594 Ptr_7_SSR15 272 9.000 2.832 1.249 0.993 0.647 0.536 Ptr_13_SSR6 272 7.000 2.343 1.012 0.985 0.573 0.576 Ptr_19_SSR1 272 4.000 1.034 0.098 0.033 0.033 0.013 均值Mean 272 6.625 2.075 0.825 0.561 0.432 0.364 2.2 不同种源毛白杨无性系的遗传多样性分析
由于甘肃、安徽、江苏3个种源无性系数量均小于10，未满足生物统计学要求，本研究仅对北京、河北、山东、河南、陕西、山西6个种源的无性系进行遗传多样性分析。16对SSR引物对6个不同种源的234个样本共扩增出71个等位基因，每位点的等位基因数为1~9个，平均每位点扩增出4.438个等位变异，最多的是Ptr-7-SSR14有9个等位变异，Ptr_18_SSR17次之，有8个变异，最少的是Ptr_16_SSR3，只有1个等位基因(表 4)；各遗传多样性指数(Na、Ne、Ho、He、I、F)平均值分别是4.438、2.018、0.568、0.412、0.740和-0.244，其中Ptr-7-SSR14位点的He值最高为0.731，其次是Ptr_13_SSR6，He值为0.644，最低的是Ptr_16_SSR3为0。
表 4 16个位点234个毛白杨无性系的SSR多态性分析Table 4. Polymorphism analysis of 234 clones of Populus tomentosa at 16 SSR locus位点
Locus样本量
Sample number(N)等位基因数
Allele number(Na)有效等位基因数
Effective number of allele(Ne)Shannon信息指数
Shannon information index(I)观测杂合度
Observed heterozygosity(Ho)期望杂合度
Expected heterozygosity(He)Ptr-1-SSR2 234 3.000 2.034 0.736 0.996 0.508 Ptr-7-SSR14 234 9.000 3.716 1.488 0.932 0.731 Ptr-1-SSR1 234 3.000 1.882 0.824 0.303 0.469 Ptr_9_SSR3 234 3.000 1.022 0.066 0.004 0.021 Ptr_11_SSR1 234 4.000 2.378 0.961 0.966 0.579 Ptr_10_SSR1 234 6.000 2.866 1.214 0.996 0.651 Ptr_11_SSR8 234 2.000 1.004 0.015 0.004 0.004 Ptr_14_SSR12 234 6.000 1.868 0.903 0.577 0.465 Ptr_14_SSR7 234 5.000 1.985 0.965 0.534 0.496 Ptr_16_SSR3 234 1.000 1.000 0.000 0.000 0.000 Ptr_3_SSR13 234 2.000 1.347 0.426 0.295 0.257 Ptr_14_SSR11 234 3.000 2.009 0.707 1.000 0.502 Ptr_18_SSR17 234 8.000 2.783 1.275 0.470 0.641 Ptr_7_SSR15 234 6.000 2.576 1.048 1.000 0.612 Ptr_13_SSR6 234 6.000 2.811 1.160 0.996 0.644 Ptr_19_SSR1 234 4.000 1.013 0.046 0.013 0.013 平均Mean 234 4.438 2.018 0.740 0.568 0.412 由表 5可以看出16对SSR引物在6个种源共234个样本中实际观察杂合度(Ho)在0.524(山东)~0.593(北京)之间，平均Ho值为0.564。平均期望杂合度(He)在0.361(山东)~0.423(陕西)之间，平均He值为0.396。6个种源He值均小于0.5，表明遗传多样性中度丰富；另外，这6个种源的Ho/He比值均大于1，表明这6个种源的无性系杂合度较高。
表 5 6个种源毛白杨无性系遗传多样性分析Table 5. Genetic diversity of 6 provenances of Populus tomentosa种源
Provenance代码
CodeN Na Ne I Ho He 北京Beijing BJ 25.000 2.375 1.895 0.630 0.593 0.391 河北Hebei Province HB 56.000 3.125 1.912 0.672 0.578 0.393 山东Shandong Province SD 18.000 2.750 1.845 0.631 0.524 0.361 河南Henan Province HN 42.000 3.125 2.091 0.735 0.563 0.415 山西Shanxi Province SX 44.000 3.750 1.912 0.706 0.544 0.391 陕西Shaanxi Province SHX 49.000 3.250 2.071 0.747 0.585 0.423 平均Mean 39.000 3.063 1.954 0.687 0.564 0.396 由图 1和表 6可以看出山西、陕西、河南、山东和河北这5个种源的无性系均出现了特有等位基因，因此，选择及杂交育种要尽量选择不同种源的无性系，以提高种群及杂交子代的抗病、抗虫、抗旱、抗寒、抗盐碱等抗性，即增加毛白杨良种的遗传基础。另外，这些种源之间可以适当相互引种，以增加不同种源间的遗传多样性。
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图 1 种源的等位基因模型NaF.等位基因频率；PA.特有等位基因数；CA.共有等位基因数(≤25%)。Figure 1. Allelic patterns across provenancesNaF, allele frequency; PA, private alleles; CA, common alleles.表 6 不同种源的特有等位基因和频率Table 6. Private alleles and frequencies of different provenances种源
Provenance位点
Locus等位基因
Allele特有等位基因频率
Private allele and gene frequency河北Hebei Province Locus2 354 0.009 山东Shandong Province Locus2 369 0.028 Locus8 343 0.028 河南Henan Province Locus6 235 0.012 Locus7 294 0.012 山西Shanxi Province Locus2 393 0.011 Locus6 229 0.011 Locus8 345 0.011 Locus9 253 0.011 Locus12 348 0.011 Locus14 347 0.011 Locus14 355 0.011 Locus15 345 0.011 Locus15 357 0.011 Locus16 292 0.011 陕西Shaanxi Province Locus4 269 0.02 Locus13 193 0.01 Locus14 359 0.02 Locus16 280 0.01 Locus16 281 0.01 2.3 种源和无性系的遗传变异分析
6个种源的234个无性系的遗传变异分析表明：98%的遗传变异来自于种源内无性系间；种源间只出现2%的遗传变异(图 2)。根据毛白杨主要适生分布区情况研究发现，由于黄河水域的传播作用，使毛白杨沿着黄河向不同地区延伸，使不同种源间的毛白杨基因交流频繁，造成不同种源间毛白杨遗传变异变小，从而造成主要遗传变异来源于种源内无性系间。
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图 2 毛白杨种源和无性系的遗传变异Figure 2. Genetic variations of provenances and clones of Populus tomentosa2.4 种源的主坐标分析
6个种源的主坐标分析表明，北京和河北无性系亲缘关系较近，聚为一大类群；河南和陕西亲缘关系也较近，聚为一类；山东和山西亲缘关系次近，聚为一类(图 3)。何承忠利用AFLP标记对毛白杨无性系进行聚类分析发现，河北种源(含北京)、山西种源无性系具有比较强的地域代表性，二者间基因交流比较少，而中间被河南、山东、陕西等种源的部分无性系构成的一个分隔区，其中山东是两大类群基因交流的过渡区[14]，这与本研究结论不一致，这可能与所用分子标记类型及试验材料不一致有关。
2.5 不同种源的遗传关系分析
由表 7 Nei's遗传距离可知，6个种源的无性系遗传距离最小值是0.004，最大值是0.066。北京和河北的遗传距离最小(0.004)，表明这两个种源的遗传分化差异最小；北京和陕西的遗传距离最大(0.066)，表明这两个种源的遗传分化差异也最大。
表 7 6个种源间的Nei's遗传距离Table 7. Nei's genetic distance among six provenances种源Provenance 北京
Beijing河北
Hebei Province山东
Shandong Province河南
Henan Province山西
Shanxi Province陕西
Shaanxi Province北京Beijing 0 河北Hebei Province 0.004 0 山东Shandong Province 0.032 0.02 0 河南Henan Province 0.034 0.022 0.02 0 山西Shanxi Province 0.012 0.004 0.01 0.014 0 陕西Shaanxi Province 0.066 0.047 0.041 0.016 0.035 0 根据Nei's遗传距离得到的UPGMA系统关系图(图 4)，表明北京和河北的亲缘关系最近，河南和陕西的亲缘关系也较近。此结果和主坐标分析结果基本一致。
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图 4 基于Nei's遗传距离的毛白杨不同种源UPGMA系统关系图Figure 4. UPGMA clustering tree of Populus tomentosa provenances based on Nei's genetic distance2.6 无性系间的聚类分析
基于16对引物使用Ward法(Ward’s method)对收集到的国内外272份白杨派无性系进行聚类分析(图 5)，272个无性系聚类成5大分支，组成每一分支的种源和无性系数量见表 8。
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图 5 基于16对SSR引物的272个白杨派无性系聚类图Figure 5. Cluster diagram of 272 clones of Leuce based on 16 SSR primers表 8 白杨派无性系聚类图各个分支的数量及其来源Table 8. Quantity and source of Leuce clones in each branch of cluster diagram分类
Classification北京
Beijing河北
HebeiProvince山东
ShandongProvince河南
HenanProvince山西
ShanxiProvince陕西
ShaanxiProvince甘肃
GansuProvince安徽
AnhuiProvince江苏
JiangsuProvince新疆杨
P. bolleana白杨杂种
WPH总计
Total1 12 21 4 11 12 10 1 2 2 0 0 75 2 12 29 7 7 24 8 3 2 0 0 0 92 3 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 11 14 4 0 2 0 6 4 20 0 0 1 0 0 33 5 1 4 8 17 3 11 1 5 0 0 8 58 总计Total 25 56 19 41 44 49 5 9 4 1 19 272 从表 8可以看出，参试无性系并没有按照不同种源聚类到一大类群，这与不同种源刺槐(Robinia pseudoacacia)的聚类结果基本一致[17]。北京有24个无性系聚类到第1、2分支，占96%；河北的无性系也是主要聚集在第1、2分支，有50个，占89.29%；山东的无性系主要聚集在第2和第5分支，有15个，占78.95%；河南的无性系主要聚集在第1、5分支，有28个，占68.29%；山西有36个无性系聚类到第1、2分支，占81.82%；陕西有31份种质无性系聚类到第4、5分支，占63.27%；而白杨杂种主要分布在第3分支，占57.89%，新疆杨与大部分白杨杂种均分布第3分支。分析可能的原因有两个：一是无性系间的遗传变异导致；二是不同省份间人为引种造成的。
3. 结论与讨论
随着分子生物学的不断发展，分子标记已成为揭示植物遗传多样性的有效手段，以AFLP、SSR等为代表的DNA分子标记技术由于无器官、组织特异性且不受环境因素影响，具有检测位点的数量多等优点[19]，而SSR标记与其他标记相比，具有灵敏度高、共显性遗传等优点，近年来已广泛应用于大豆、水稻、玉米等植物遗传图谱构建、基因定位等研究领域[20-21]。
目前，已有研究者开展了白杨派种质资源遗传多样性研究，王彦珍等对来自5个省份的130个毛白杨无性系进行了AFLP分析，研究发现，来源相同的毛白杨无性系并没有完全聚在一起，这与本研究有相似的研究结论[16]；何承忠运用AFLP技术对9个省份的211个毛白杨无性系进行了分析，聚类结果显示，河北种源(含北京)、山西种源无性系具有比较强的种源代表性，二者间基因交流比较少，形成相对独立的两个类群[14]；陈罡等利用SRAP标记对辽宁省17份杨树资源进行了遗传变异分析，通过聚类分析将17份杨树资源分为4个类群，其划分结果与传统分类基本一致[22-23]；郑书星等利用SSR分子标记技术，对采自新疆额尔齐斯河流域阿尔泰市哈巴河及北屯地区的3个白杨派树种银白杨、银灰杨、欧洲山杨的半同胞子代进行遗传变异分析，结果表明，主要变异存在于个体间，仅33.71%的变异来自于不同种之间[24]，与本研究有类似结论。综上所述，由于研究者利用白杨派种质材料及分子标记类型的不同，研究结论也不尽相同，但通过比较发现，非荧光SSR标记检测所得胶图是用肉眼来粗略分辨的，难以区分5个及以下碱基的差异，检测变异数较低，而荧光SSR标记可兼具分辨率高、多态性丰富、共显性等特点，能检测到传统SSR标记识别不出的等位变异[25-27]。本文选用荧光SSR标记技术，利用16对SSR引物对白杨派的272个样本共扩增出106个等位基因，等位基因数变化范围为4~11个，平均等位基因数为6.625个，而前人研究结果均小于6个[27-29]，说明荧光SSR标记能够揭示白杨派种质资源较高的遗传变异。
由毛白杨不同种源间的等位基因模型可知，山西、陕西、河南、山东和河北5个种源的无性系均有特有等位基因，人工杂交时可适当选择不同种源的无性系作为亲本，或适当引种，以拓宽遗传基础，增加毛白杨种源间的遗传多样性。由Nei's遗传距离可知，北京和陕西的遗传距离最远，为0.066，说明遗传分化差异最大；北京和河北的遗传距离最近，为0.004，说明这两个种源的遗传分化差异较小。在一定距离范围内，分布较远且不同类型的种群间、遗传组成上基因杂合度相对较高的种群间杂交，子代可获得较高的遗传变异[30-31]；一般来说，双亲遗传差异越大，子代会表现出较强杂种优势，优良个体数量就越多[32-34]，以上结果可为毛白杨杂交育种的亲本选择提供理论依据。毛白杨的6个种源234个无性系间的遗传变异分析表明，98%的遗传变异来自于种源内无性系间；种源间只出现2%的遗传变异，产生这种变异的原因是毛白杨主要分布于黄河中下游地区，由于水流的传播作用，使毛白杨沿着黄河向不同地区延伸，使不同种源间的毛白杨基因交流频繁，造成毛白杨种源间遗传变异变小[14]。因此，在毛白杨遗传改良过程中，应以优树选择和单株改良为主，种源研究为辅[5, 14]。本研究仅在分子标记方面研究了毛白杨不同种源无性系的遗传变异，今后还需结合形态学和生物学特性进一步来探讨毛白杨种质资源的谱系关系。
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图 1 种源的等位基因模型
NaF.等位基因频率；PA.特有等位基因数；CA.共有等位基因数(≤25%)。
Figure 1. Allelic patterns across provenances
NaF, allele frequency; PA, private alleles; CA, common alleles.
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图 2 毛白杨种源和无性系的遗传变异
Figure 2. Genetic variations of provenances and clones of Populus tomentosa
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图 4 基于Nei's遗传距离的毛白杨不同种源UPGMA系统关系图
Figure 4. UPGMA clustering tree of Populus tomentosa provenances based on Nei's genetic distance
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图 5 基于16对SSR引物的272个白杨派无性系聚类图
Figure 5. Cluster diagram of 272 clones of Leuce based on 16 SSR primers
表 1 不同种源取样数及无性系编号
Table 1 Number of samples from different provenances and clone No.
来源
Source样本数
Sample number无性系编号
Clone No.北京Beijing 25 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 河北Hebei Province 56 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 山东Shandong Province 19 82, 83, 221, 222, 232, 234, 235, 237, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 254, 255 河南Henan Province 41 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 223, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 257, 258, 259 山西Shanxi Province 44 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 260 陕西Shaanxi Province 49 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 238, 239, 261 甘肃Gansu Province 5 204, 205, 206, 207, 208 安徽Anhui Province 9 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217 江苏Jiangsu Province 4 218, 219, 220, 263 白杨杂种White poplar hybrid
(WPH)19 224, 231, 233, 236, 240, 241, 250, 252, 253, 256, 262, 264, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272 新疆杨P. bolleana 1 265 
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表 2 引物序列信息
Table 2 Primer sequence information
SSR编码
SSR code重复单元
Repeat motifSSR位置
Position of SSR正向引物序列
LP sequence反相引物序列
RP sequencePtr_1_SSR1 [CCT]5 61857~61870 AAAGCTTGTGTTCCACTTGT CAGATCTACCTCCTCCATCA Ptr_1_SSR2 [AAGA]6 98103~98127 TCTCAATTACATCCCAATCC GGTTGATTCACCAGCAGTAT Ptr_3_SSR13 [TA]10 12067876~12067894 AGTTGTTTGGGCTGTGTATC GTGCAATTCCCTGATTTAAG Ptr_7_SSR14 [ATT]6 1689228~1689246 TCCCACAAGCACTCTTAACT CCTTTGCAGCACAGTAGTAA Ptr_7_SSR15 [TG]12 1788775~1788798 CACTTGCTCTTACTCCTGCT CCAGGACAAATGCAATACTT Ptr_9_SSR3 [CGA]7 464617~464636 TCGAATTCTCCGATAGTGTT AATGCTTTCTTATGCTGCTC Ptr_10_SSR1 [GAC]9 364056~364082 CCAACAACAAGTACCCTCAT AGCTAGAGTCCTGTCTGCTG Ptr_11_SSR1 [TA]29 32355~32412 TGAATGAAATACATTGCTGC GCTATTATTGGATTTGCCTG Ptr_11_SSR8 [AT]30 3040852~3040911 AAATGGAGACTTGTGTGGAC GTGCAATAAAGCAGTGTGAA Ptr_13_SSR6 [GAA]8 732759~732781 TGGTACTCTCCTCTTGCCTA CCTTCAGTTTCTGCTTCATC Ptr_14_SSR7 [GCG]6 714903~714919 TGATTCTACTGGATCCAACC TATCCGATTCTCTAAGGCAA Ptr_14_SSR11 [TCC]8 1130007~1130029 CTCTCAGTTCTCTTGGATCG GAGGTCTCATTTGTTGAAGC Ptr_14_SSR12 [AT]13 1300753~1300777 TACTGGTGGTGCTCAATACA AAAGCAAACGCAGTAATAGC Ptr_16_SSR3 [AT]10 567670~567689 GGGATTTCACCACTTATTGA TTATATTTGTCTGGGAGCGT Ptr_18_SSR17 [AT]13 6997967~6997992 TTTCTGATGCTGTAGCTGTG ATCAGTATGCTTTGCCTGTT Ptr_19_SSR1 [TCA]8 110734~110756 ATTTCTTTCGCCTCATAACA CCCTCTTTGTGTGGAATTTA
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表 3 16个位点272个白杨派样品SSR引物多态性分析
Table 3 Polymorphism analysis of 272 clones of Leuce at 16 SSR locus
位点
Locus样本量
Sample number等位基因数
Allele number有效等位基因数
Effective number of alleleShannon信息指数
Shannon information index观测杂合度
Observed heterozygosity(Ho)期望杂合度
Expected heterozygosity(He)多态信息指数
Polymorphic information indexPtr-1-SSR2 272 5.000 2.236 0.898 0.952 0.553 0.388 Ptr-7-SSR14 272 9.000 3.992 1.573 0.897 0.750 0.691 Ptr-1-SSR1 272 5.000 1.840 0.837 0.287 0.456 0.423 Ptr_9_SSR3 272 5.000 1.098 0.238 0.022 0.089 0.021 Ptr_11_SSR1 272 7.000 2.604 1.134 0.923 0.616 0.494 Ptr_10_SSR1 272 6.000 2.390 1.000 0.982 0.582 0.597 Ptr_11_SSR8 272 5.000 1.038 0.113 0.018 0.036 0.004 Ptr_14_SSR12 272 9.000 2.060 1.058 0.599 0.515 0.429 Ptr_14_SSR7 272 5.000 2.054 1.033 0.537 0.513 0.461 Ptr_16_SSR3 272 6.000 1.034 0.109 0.015 0.033 0.000 Ptr_3_SSR13 272 7.000 1.463 0.583 0.279 0.316 0.224 Ptr_14_SSR11 272 6.000 2.088 0.812 0.978 0.521 0.378 Ptr_18_SSR17 272 11.000 3.103 1.446 0.482 0.678 0.594 Ptr_7_SSR15 272 9.000 2.832 1.249 0.993 0.647 0.536 Ptr_13_SSR6 272 7.000 2.343 1.012 0.985 0.573 0.576 Ptr_19_SSR1 272 4.000 1.034 0.098 0.033 0.033 0.013 均值Mean 272 6.625 2.075 0.825 0.561 0.432 0.364
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表 4 16个位点234个毛白杨无性系的SSR多态性分析
Table 4 Polymorphism analysis of 234 clones of Populus tomentosa at 16 SSR locus
位点
Locus样本量
Sample number(N)等位基因数
Allele number(Na)有效等位基因数
Effective number of allele(Ne)Shannon信息指数
Shannon information index(I)观测杂合度
Observed heterozygosity(Ho)期望杂合度
Expected heterozygosity(He)Ptr-1-SSR2 234 3.000 2.034 0.736 0.996 0.508 Ptr-7-SSR14 234 9.000 3.716 1.488 0.932 0.731 Ptr-1-SSR1 234 3.000 1.882 0.824 0.303 0.469 Ptr_9_SSR3 234 3.000 1.022 0.066 0.004 0.021 Ptr_11_SSR1 234 4.000 2.378 0.961 0.966 0.579 Ptr_10_SSR1 234 6.000 2.866 1.214 0.996 0.651 Ptr_11_SSR8 234 2.000 1.004 0.015 0.004 0.004 Ptr_14_SSR12 234 6.000 1.868 0.903 0.577 0.465 Ptr_14_SSR7 234 5.000 1.985 0.965 0.534 0.496 Ptr_16_SSR3 234 1.000 1.000 0.000 0.000 0.000 Ptr_3_SSR13 234 2.000 1.347 0.426 0.295 0.257 Ptr_14_SSR11 234 3.000 2.009 0.707 1.000 0.502 Ptr_18_SSR17 234 8.000 2.783 1.275 0.470 0.641 Ptr_7_SSR15 234 6.000 2.576 1.048 1.000 0.612 Ptr_13_SSR6 234 6.000 2.811 1.160 0.996 0.644 Ptr_19_SSR1 234 4.000 1.013 0.046 0.013 0.013 平均Mean 234 4.438 2.018 0.740 0.568 0.412
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表 5 6个种源毛白杨无性系遗传多样性分析
Table 5 Genetic diversity of 6 provenances of Populus tomentosa
种源
Provenance代码
CodeN Na Ne I Ho He 北京Beijing BJ 25.000 2.375 1.895 0.630 0.593 0.391 河北Hebei Province HB 56.000 3.125 1.912 0.672 0.578 0.393 山东Shandong Province SD 18.000 2.750 1.845 0.631 0.524 0.361 河南Henan Province HN 42.000 3.125 2.091 0.735 0.563 0.415 山西Shanxi Province SX 44.000 3.750 1.912 0.706 0.544 0.391 陕西Shaanxi Province SHX 49.000 3.250 2.071 0.747 0.585 0.423 平均Mean 39.000 3.063 1.954 0.687 0.564 0.396
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表 6 不同种源的特有等位基因和频率
Table 6 Private alleles and frequencies of different provenances
种源
Provenance位点
Locus等位基因
Allele特有等位基因频率
Private allele and gene frequency河北Hebei Province Locus2 354 0.009 山东Shandong Province Locus2 369 0.028 Locus8 343 0.028 河南Henan Province Locus6 235 0.012 Locus7 294 0.012 山西Shanxi Province Locus2 393 0.011 Locus6 229 0.011 Locus8 345 0.011 Locus9 253 0.011 Locus12 348 0.011 Locus14 347 0.011 Locus14 355 0.011 Locus15 345 0.011 Locus15 357 0.011 Locus16 292 0.011 陕西Shaanxi Province Locus4 269 0.02 Locus13 193 0.01 Locus14 359 0.02 Locus16 280 0.01 Locus16 281 0.01
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表 7 6个种源间的Nei's遗传距离
Table 7 Nei's genetic distance among six provenances
种源Provenance 北京
Beijing河北
Hebei Province山东
Shandong Province河南
Henan Province山西
Shanxi Province陕西
Shaanxi Province北京Beijing 0 河北Hebei Province 0.004 0 山东Shandong Province 0.032 0.02 0 河南Henan Province 0.034 0.022 0.02 0 山西Shanxi Province 0.012 0.004 0.01 0.014 0 陕西Shaanxi Province 0.066 0.047 0.041 0.016 0.035 0
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表 8 白杨派无性系聚类图各个分支的数量及其来源
Table 8 Quantity and source of Leuce clones in each branch of cluster diagram
分类
Classification北京
Beijing河北
HebeiProvince山东
ShandongProvince河南
HenanProvince山西
ShanxiProvince陕西
ShaanxiProvince甘肃
GansuProvince安徽
AnhuiProvince江苏
JiangsuProvince新疆杨
P. bolleana白杨杂种
WPH总计
Total1 12 21 4 11 12 10 1 2 2 0 0 75 2 12 29 7 7 24 8 3 2 0 0 0 92 3 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 11 14 4 0 2 0 6 4 20 0 0 1 0 0 33 5 1 4 8 17 3 11 1 5 0 0 8 58 总计Total 25 56 19 41 44 49 5 9 4 1 19 272
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