Construction of SSR fingerprint and research of genetic structure in relative Quercus species
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摘要:目的对栎属近缘种质进行指纹图谱构建，并分析其遗传结构，为栎属近缘种鉴定及分类提供了重要工具。方法以23份栎属近缘种质为研究对象，利用遗传背景差异大的4份种质进行SSR引物筛选，选出9对扩增条带清晰、具有多态性且重复性好的引物对其进行扩增，利用毛细管电泳技术对PCR荧光产物进行检测，采用引物-分子量组合法构建23份种质的指纹图谱，利用NTsys和STRUCTURE软件进行聚类分析和群体遗传结构分析。结果9对SSR引物共扩增出78个条带，每个位点的等位标记数4~14个，平均每对引物为8.67个，多态信息含量变幅为0.58~0.82，平均为0.73。聚类分析显示辽东栎、蒙古栎分别聚为两个类群，猩红栎和北美红栎聚为一个类群，群体遗传结构分析显示23份种质为3个亚群体，遗传结构分析与聚类分析结果一致。结论23份栎属近缘种质可以划分为辽东栎组、蒙古栎组、猩红栎-北美红栎混合组，辽东栎与蒙古栎是两个独立的分类单位，上述结果为栎属分类、品种鉴定和知识产权保护提供了理论依据。Abstract:ObjectiveThe fingerprint of the relative Quercus species was constructed and the genetic structure was analyzed, it provides an important tool for the identification and classification in relative Quercus species in order to classify and identify the relative Quercus species.Method23 germplasms of relative Quercus were used as the materials in this study, SSR primers were selected by 4 accessions of genetically distant germplasms, 9 pairs of primers with clear amplification bands, high polymorphism and stable repeatability were selected and used for PCR amplification of the 23 germplasms, PCR products labeled fluorescent were detected using capillary electrophoresis technology, a strategy of combining primer pair with molecular weight for fingerprint construction was developed and applied to the 23 germplasms, the software of NTsys and STRUCTURE were used in clustering analysis and population genetic structure analysis.ResultThe 78 fragments were amplified by 9 pairs of SSR primers, the number of alleles at each locus was between 4 and 14, with an average of 8.67 alleles for each pair of primers, polymorphism information content values for the primer pairs ranged from 0.58 to 0.82, with an average of 0.73. Clustering analysis showed that Quercus liaotungensis and Quercus monglica were respectively divided into two groups, Quercus coccinea and Quercus rubra were clustered into a group, population genetic structure analysis showed that 23 germplasms for the three groups, genetic structure analysis and clustering analysis results were consistent.ConclusionThe 23 germplasms are divided into Quercus liaotungensis group, Quercus monglica group, Quercus coccinea-Quercus rubra mixed group, Quercus liaotungensis and Quercus monglica are two separate taxonomies, the results provide a theoretical basis for Quercus classification, variety identification and protection of intellectual property centers.
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Keywords:
- Quercus liaotungensis /
- Quercus monglica /
- fingerprint /
- genetic structure
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栎属(Quercus)植物在全世界约有450余种，中国约有51种，分布在全国各省区，多为组成森林的重要树种[1]。近年来，我国的栎属育种工作发展迅速，培育出大量的新品种，但是部分品种之间的形态学差异小，给栎属品种的鉴定和知识产权保护增加了困难。此外，由于栎属植物为风媒异交植物，树种间的自然杂交很常见[2-3]，造成了栎属的近缘种间分类困难，因此对栎属品种进行准确快速的鉴定以及为栎属的分类提供理论依据成为当务之急。随着分子生物学的快速发展，DNA指纹图谱作为一种遗传种质分析的新方法，可以直接反映植物遗传物质在DNA分子水平上的差异，具有准确、高效、经济、不受环境影响等优点。目前构建DNA指纹图谱的标记方法有多种，SSR(simple sequence repeat)分子标记由于扩增稳定、重复性好、操作简便、易于推广，已被国际植物品种权保护联盟(UPOV)认定为植物新品种保护最广泛应用的标记体系[4]。
蒙古栎(Quercus monglica)和辽东栎(Quercus liaotungensis)在我国分布广泛，分布区上有重叠，同域内存在大量杂交，形态差异不明显，导致品种难以区别和物种地位难以鉴定。目前，对蒙古栎和辽东栎的研究主要集中在形态特征[5]、遗传多样性[6-7]、分类地位[8-9]、物种形成原因[10]等方面。北美红栎(Quercus rubra)和猩红栎(Quercus coccinea)是美国红栎组的主要树种[11]，红栎近缘种存在大量的种间杂交，物种之间存在基因流和基因渐渗等现象[12-13]，形态上分别难度大[14]。目前，对红栎近缘种的研究主要集中在遗传多样性[15]、遗传结构[16]、分类地位[17]等方面。本研究选取蒙古栎、辽东栎、猩红栎、北美红栎等23份栎属近缘种质，利用SSR分子标记进行指纹图谱构建和遗传结构研究，为栎属近缘品种鉴定和栎属分类提供科学的理论依据，同时为栎属的育种工作奠定坚实的基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
23份栎属近缘种质(表 1)保存在山西省林业科学研究院阳曲实验基地，2017年5月取春季刚长出的新鲜叶片，液氮冷冻后保存在-80 ℃冰箱备用。
表 1 试验材料Table 1. Experimental materials编号Code 种质Germplasm 种源Provenance Q1 晋辽东栎1号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong1’ 山西省中条山国有林管理局横河林场，良种编号：晋R-SC-QL-001-2016
Shanxi Province Zhongtiao Mountain State Forest Administration, Henghe Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-001-2016Q2 晋辽东栎2号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong2’ 山西省太岳山国有林管理局灵空山林场，良种编号：晋R-SC-QL-002-2016
Shanxi Province Taiyue Mountain State Forest Administration, Lingkongshan Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-002-2016Q3 晋辽东栎3号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong3’ 山西省吕梁山国有林管理局康城林场，良种编号：晋R-SC-QL-003-2016
Shanxi Province Lüliang Mountain State Forest Administration, Kangcheng Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-003-2016Q4 晋辽东栎4号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong4’ 山西省吕梁山国有林管理局东山林场，良种编号：晋R-SC-QL-004-2016
Shanxi Province Lüliang Mountain State Forest Administration, Dongshan Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-004-2016Q5 晋辽东栎5号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong5’ 山西省太行山国有林管理局坪松林场，良种编号：晋S-SS-QL-005-2014
Shanxi Province Taihang Mountain State Forest Administration, Pinsong Forest Farm, the code of improved variety: Jin S-SS-QL-005-2014Q6 晋辽东栎6号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong6’ 山西省关帝山国有林管理局真武山林场，良种编号：晋S-SS-QL-006-2014
Shanxi Province Guandi Mountain State Forest Administration, Pinsong Forest Farm, the code of improved variety: Jin S-SS-QL-006-2014Q7 蒙古栎1号Quercus monglica 1 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q8 蒙古栎2号Quercus monglica 2 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q9 蒙古栎3号Quercus monglica 3 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q10 蒙古栎4号Quercus monglica 4 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q11 蒙古栎5号Quercus monglica 5 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q12 猩红栎1号Quercus coccinea 1 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q13 猩红栎2号Quercus coccinea 2 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q14 猩红栎3号Quercus coccinea 3 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q15 猩红栎4号Quercus coccinea 4 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q16 猩红栎5号Quercus coccinea 5 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q17 猩红栎6号Quercus coccinea 6 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q18 北美红栎1号Quercus rubra 1 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q19 北美红栎2号Quercus rubra 2 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q20 北美红栎3号Quercus rubra 3 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q21 北美红栎4号Quercus rubra 4 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q22 北美红栎5号Quercus rubra 5 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q23 北美红栎6号Quercus rubra 6 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina 1.2 DNA的提取及SSR引物的筛选
从冰箱中取大约10 g叶片，置于液氮预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨至粉末，用无菌小勺取大约0.2 g研磨好的粉末，加入盛有DNA提取缓冲液的2 mL离心管，轻弹离心管混匀，然后置于65 ℃水浴放置30 min。随后参照CTAB法[18]进行操作，提取DNA。取1 μL DNA样本在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳检测，结果拍照记录，其余DNA于-20 ℃保存备用。
从蒙古栎、北美红栎、猩红栎中筛选出9对多态性好、扩增条带清晰的引物[19-22]对23份种质进行SSR-PCR扩增，荧光标记SSR引物由睿博兴科生物技术有限公司合成，引物序列信息如下(表 2)。
表 2 SSR引物信息表Table 2. Table of SSR primer information引物名称
Primer name正向引物
Forward primer (5′→3′)反向引物
Reverse primer(5′→3′)ssrQrZAG 96 CCCAGTCACATCCACTACTGTCC GGTTGGGAAAAGGAGATCAGA ssrQrZAG 102 GCCTACACTCTTCAATCTACATGA GACTTGTAACACCTTAAGCATTATCT ssrQrZAG 112 TTCTTGCTTTGGTGCGCG GTGGTCAGAGACTCGGTAAGTATTC ssrQrZAG 7 CAACTTGGTGTTCGGATCAA GTGCATTTCTTTTATAGCATTCAC Qden 03011 AACCC AACCTTCCCTTCATC GCAGTGGTGCCTAATGTAGAC Qden 03021 ACAGCAAACCAGACTCCAC CCCCAAAGTTTCGGCTAATAC Qden 03032 AGTTGTGGTCCTGCTCGC GAAAAGTGCGATGACGGTTG Qden 05011 CCCACTCCCTGTCCATTGT CACTGTGTGCTGCGACTTG Qden 05031 CCCCGATTCGCCATCATTGT GTAACGCCGTTTTTCTCCACC 1.3 PCR扩增和毛细管电泳检测
PCR反应体系为20 μL，包括成分为: DNA 1 μL，10×PCRmix 2 μL，正向引物0.2 μL，M13+正向引物0.2 μL，反向引物0.4 μL，Taq酶0.2 μL，ddH2O16 μL。PCR程序如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s, 58 ℃复性20 s, 72 ℃延伸20 s，30轮循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反应在ABI 9700 PCR仪中进行。PCR产物送交北京睿博兴科生物技术有限公司进行毛细管电泳分析，用Gene-Marker软件进行数据分析。
1.4 指纹图谱构建
得到每份种质在每个引物的扩增结果后，以所分析的SSR引物为前缀，该标记在某样本上的分子量为后缀，按照固定的引物排序综合不同引物分析结果，形成该种质的SSR指纹图谱。
1.5 数据分析
对Gene-Marker软件获得的数据转化成0，1数据，建立原始矩阵后用NTSYS-pc 2.10e软件[23]进行分析。利用NTSYS中的Qualitative date模块计算任意两个个体间的相似系数(GS)，GS=2Nij/(Ni+Nj)，式中：Nij为i和j个体共有的谱带数，Ni和Nj为i和j个体的谱带数。以clustering程序中SHAN进行UPGMA(非加权组平均法)聚类分析，绘制亲缘关系树状图。多态信息含量(PIC)按下列公式计算: PIC=1-∑Pi2，式中：Pi表示第i个等位位点出现的频率[24]。
利用STRUCTURE 2.3.4软件[25]对栎属群体遗传结构进行估测，首先假定位点都是独立的，设定群体数目K为1~10，将MCMC(Markov chain Monte Carlo)开始时的不作数迭代(Length of bum-in period)设为10 000次，再将不作数迭代后的MCMC设为100 000次[26]，然后计算出每个K值对应的InP(D)值，重复计算10次，计算出K值对应的平均InP(D)，随后利用Evanno等设计的Delta K法，计算出K-1个Delta K，最终根据所有峰状图的波动情况确定最高Delta K对应的K值，即为群体遗传结构的最佳亚群体数[27]。
2. 结果与分析
2.1 SSR引物的多态性分析和指纹图谱构建
利用筛选出的9对引物对23份栎属近缘种质进行扩增。9对引物在23份种质中共扩增出78个条带且都是多态条带，多态性片段百分率达100%，每个引物的等位标记数4~14个，平均每对引物为8.67个，各引物的PIC值变幅为0.58~0.82，平均为0.73(表 3)。图 1为晋辽东栎2号~5号、蒙古栎1号~5号在引物ssrQrZAG 112中的扩增情况。参照9对核心引物扩增结果的峰图，准确读出每个等位位点的分子量，利用引物-分子量组合法构建了23份种质的指纹图谱(表 4)，可以将23份种质区别开，最少只用6对引物组合(ssrQrZAG96、ssrQrZAG112、ssrQrZAG7、Qden03011、Qden03021、Qden 05011)就可以区别开，其中引物ssrQrZAG7可以鉴别的种质最多，达12个。各个种质的指纹图谱互不相同，说明23份种质没有重复个体，引物的区分度较高，可以将实验结果用于栎属近缘种的品种鉴定。
表 3 9对SSR引物的多态检测Table 3. Polymorphism detection of 9 pairs of SSR primer引物名称
Primer name等位标记数
Allele number多态信息含量
PICssrQrZAG 96 8 0.76 ssrQrZAG 102 14 0.82 ssrQrZAG 112 8 0.77 ssrQrZAG 7 10 0.71 Qden 03011 7 0.65 Qden 03021 4 0.58 Qden 03032 7 0.78 Qden 05011 12 0.79 Qden 05031 8 0.72 总计Total 78 平均Mean 8.67 0.73 ![]()
图 1 引物ssrQrZAG 112在辽东栎和蒙古栎中的扩增图谱Figure 1. Polymorphic fingerprint detected by ssrQrZAG112 for Quercus liaotungensis and Quercus monglica表 4 23份种质的指纹图谱Table 4. Fingerprint of 23 germplasms based on SSR markers编号Code 指纹图谱Fingerprint Q1 ssrQrZAG96, 152, 152 ssrQrZAG112, 78, 90 ssrQrZAG7, 124, 140 Qden03011, 142, 144 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 174, 180 Q2 ssrQrZAG96, 154, 166 ssrQrZAG112, 81, 81 ssrQrZAG7, 134, 140 Qden03011, 140, 150 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 180, 188 Q3 ssrQrZAG96, 145, 150 ssrQrZAG112, 96, 98 ssrQrZAG7, 128, 138 Qden03011, 140, 140 Qden03021, 252, 256 Qden 05011, 176, 178 Q4 ssrQrZAG96, 150, 168 ssrQrZAG112, 90, 90 ssrQrZAG7, 126, 128 Qden03011, 140, 140 Qden03021, 252, 260 Qden 05011, 172, 180 Q5 ssrQrZAG96, 160, 186 ssrQrZAG112, 88, 90 ssrQrZAG7, 124, 124 Qden03011, 140, 142 Qden03021, 254, 256 Qden 05011, 176, 192 Q6 ssrQrZAG96, 154, 166 ssrQrZAG112, 90, 94 ssrQrZAG7, 126, 126 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 252, 260 Qden 05011, 180, 186 Q7 ssrQrZAG96, 147, 149 ssrQrZAG112, 88, 94 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 137 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 175, 183 Q8 ssrQrZAG96, 147, 151 ssrQrZAG112, 88, 88 ssrQrZAG7, 124, 124 Qden03011, 137, 137 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 175, 183 Q9 ssrQrZAG96, 147, 149 ssrQrZAG112, 88, 88 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 139 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 175, 175 Q10 ssrQrZAG96, 149, 149 ssrQrZAG112, 88, 98 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 139 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 177, 183 Q11 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 88, 88 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 139 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 175, 183 Q12 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 134, 146 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 185 Q13 ssrQrZAG96, 151, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 134, 146 Qden03011, 140, 142 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 185 Q14 ssrQrZAG96, 149, 149 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 130, 134 Qden03011, 138, 142 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 183, 185 Q15 ssrQrZAG96, 151, 151 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 130, 130 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 185, 185 Q16 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 130, 138 Qden03011, 140, 155 Qden03021, 256, 256 Qden 05011, 183, 185 Q17 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 96 ssrQrZAG7, 134, 138 Qden03011, 138, 138 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 183 Q18 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 129, 131 Qden03011, 140, 142 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 183 Q19 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 127, 129 Qden03011, 136, 140 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 185, 185 Q20 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 134, 144 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 183 Q21 ssrQrZAG96, 151, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 130, 134 Qden03011, 136, 136 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 183, 183 Q22 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 130, 134 Qden03011, 138, 142 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 174, 183 Q23 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 124, 130 Qden03011, 142, 151 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 180, 183 2.2 聚类分析
将9对引物扩增的条带转换为0，1矩阵，其中数据缺失记为2，用NTSYS-pc 2.10e软件进行UPGMA聚类分析，得到23份种质的聚类图(图 2)。各种质间遗传相似系数范围为0.210 5~0.857 1，平均相似系数0.64。蒙古栎5号与蒙古栎3号遗传相似系数为0.857 1，说明亲缘关系很近；猩红栎5号与晋辽东栎1号遗传相似系数为0.210 5，说明亲缘关系较远；晋辽东栎1号与5号、晋辽东栎4号与6号分别聚在了一起，蒙古栎1号~5号聚成一个类群，从聚类分析结果上看，辽东栎和蒙古栎分别聚为两个大类群，说明二者亲缘关系较远；猩红栎和北美红栎聚成了一个大类群，说明猩红栎和北美红栎亲缘关系很近。
2.3 群体遗传结构分析
本研究利用9对SSR引物对23份栎属近缘种质进行群体结构分析，利用STRUCTURE2.3.4软件确定最佳亚群体数目以及每个亚群体的组成情况，根据最大Delta K对应的K值即为最佳亚群体数目的原则，Delta K在K=3时有明显的峰(图 3)，因此23份种质的最佳亚群体数目为3。随后以对K=3时对应的个体等位标记频率组合情况等信息进行了分析，每个亚群体用一种主颜色代表，所有隶属于每个亚群体的成员个体将根据其在3个亚群体所评估的Q值，给予不同的颜色组合来代表该个体属于某一亚群的概率，揭示其成员个体在不同亚群体间基因交流以及谱系来源情况，最终获取了代表 3个亚群体的遗传结构图(图 4)，本研究发现辽东栎和蒙古栎都单独划分为一个亚群体，表明二者都可以单独作为一个遗传群体，而猩红栎和北美红栎则被组合成一个亚群体，表明它们的遗传结构相似。
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图 3 利用STRUCTURE软件检测23份种质最佳亚群体数目(K)Figure 3. Estimation of the optimal number (K) of subpopulations for 23 germplasms based on STRUCTURE![]()
图 4 23份种质的群体结构(K=3)23份栎属近缘种质被划分为3个亚群体，每一个颜色代表一个亚群体，蓝色为辽东栎亚群；红色为蒙古栎亚群；绿色为猩红栎-北美红栎亚群。Figure 4. Population structure for 23 germplasms(K=3)The 23 germplasms were clustered into 3 sub-population, each color represents a sub-population, blue color represents Quercus liaotungensis sub-population, red color represents Q. monglica sub-population, green color represents Q. coccinea-Q. rubra sub-population.3. 讨论
指纹图谱在植物品种鉴定、品种注册、亲子分析以及知识产权保护等方面具有重要作用。本研究中多态信息含量为0.58~0.82，而Coutinho等[28]利用ISSR标记构建了壳斗科(Fagaceae)28个个体的指纹图谱，多态信息含量为0.178~0.375，一方面可能是由于后者所用的引物来自于栎属，检测的却是壳斗科的水青冈属(Fagus)、栗属(Castanea)和栎属，区分能力差，另一方面后者所采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，与毛细管电泳相比，灵敏度低、可靠性差。本研究筛选出适合栎属近缘种质鉴定的SSR引物，采用毛细管电泳技术，建立了一个栎属近缘种质鉴定的SSR标记分析系统，并以引物-分子量组合法构建了23份栎属近缘种质的指纹图谱，为栎属近缘品种鉴定及知识产权保护奠定了基础。
在我国对于蒙古栎和辽东栎这两个分类群的物种地位一直存在分歧，曹明等[29]通过对栎属花粉形态的观测，认为蒙古栎和辽东栎有很近的亲缘关系，在分布重叠区发现有大量形态中间型个体。王越[20]分析了山东省莲台山辽东栎和蒙古栎群体的遗传结构和基因渐渗情况，认为辽东栎和蒙古栎不能作为两个独立的分类单位。Zeng等[9]使用AFLP和SSR两种标记类型对蒙古栎和辽东栎进行分析，两者的基因库有明显的区别，应该看为两个独立的分类单位。本研究利用基于UPGMA为基础的NTSYS软件进行聚类分析，以及基于Bayesian算法的STRUCTURE软件进行遗传结构分析，聚类分析显示辽东栎、蒙古栎亲缘关系较远，聚为两个类群，猩红栎和北美红栎亲缘关系较近，聚为一个类群；遗传结构分析显示最佳亚群体数目为3，即辽东栎、蒙古栎分别划分为一个亚群体，猩红栎与北美红栎划分为一个亚群体，且3个亚群体遗传结构有明显差异，遗传结构分析与聚类分析结果一致，都将蒙古栎与辽东栎划分为两个独立的分类单位，表明二者是两个分化的物种。红栎近缘种的分类地位一直是分类的焦点，种间存在广泛的杂交，且存在基因流和基因渐渗现象，导致种与种之间很难被识别30]，Moran等[11]对美国主要的红栎树种进行遗传结构研究，北美红栎、黑栎(Quercus velutina)和猩红栎分别聚为3个亚群体，而Coutinbo等[31]利用荧光原位杂交技术对栎属22个种进行分类学研究，北美红栎和猩红栎却聚为一个类群。本研究对猩红栎、北美红栎进行聚类分析和遗传结构分析，聚类分析显示二者聚为一个类群，群体遗传结构分析结显示二者为一个亚群体，二者没有被划分为两个独立的分类单位，因此本文将23份种质划分为辽东栎组、蒙古栎组、猩红栎-北美红栎混合组3个类群。
本文利用SSR分子标记研究栎属近缘种在基因组水平上的差异，辽东栎和蒙古栎有较大遗传差异，北美红栎和猩红栎遗传差异较小，根据研究结果我们认为辽东栎和蒙古栎有不同的基因库，是两个独立的物种。依靠现代分子生物学技术进行栎属分类和品种鉴定是必然趋势，下一步将根据栎属的测序数据筛选更多的多态引物[32]，结合传统的形态分类学方法，为近缘栎树的物种地位确定和知识产权保护奠定坚实的基础。
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图 1 引物ssrQrZAG 112在辽东栎和蒙古栎中的扩增图谱
Figure 1. Polymorphic fingerprint detected by ssrQrZAG112 for Quercus liaotungensis and Quercus monglica
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图 3 利用STRUCTURE软件检测23份种质最佳亚群体数目(K)
Figure 3. Estimation of the optimal number (K) of subpopulations for 23 germplasms based on STRUCTURE
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图 4 23份种质的群体结构(K=3)
23份栎属近缘种质被划分为3个亚群体，每一个颜色代表一个亚群体，蓝色为辽东栎亚群；红色为蒙古栎亚群；绿色为猩红栎-北美红栎亚群。
Figure 4. Population structure for 23 germplasms(K=3)
The 23 germplasms were clustered into 3 sub-population, each color represents a sub-population, blue color represents Quercus liaotungensis sub-population, red color represents Q. monglica sub-population, green color represents Q. coccinea-Q. rubra sub-population.
表 1 试验材料
Table 1 Experimental materials
编号Code 种质Germplasm 种源Provenance Q1 晋辽东栎1号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong1’ 山西省中条山国有林管理局横河林场，良种编号：晋R-SC-QL-001-2016
Shanxi Province Zhongtiao Mountain State Forest Administration, Henghe Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-001-2016Q2 晋辽东栎2号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong2’ 山西省太岳山国有林管理局灵空山林场，良种编号：晋R-SC-QL-002-2016
Shanxi Province Taiyue Mountain State Forest Administration, Lingkongshan Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-002-2016Q3 晋辽东栎3号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong3’ 山西省吕梁山国有林管理局康城林场，良种编号：晋R-SC-QL-003-2016
Shanxi Province Lüliang Mountain State Forest Administration, Kangcheng Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-003-2016Q4 晋辽东栎4号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong4’ 山西省吕梁山国有林管理局东山林场，良种编号：晋R-SC-QL-004-2016
Shanxi Province Lüliang Mountain State Forest Administration, Dongshan Forest Farm, the code of improved variety: Jin R-SC-QL-004-2016Q5 晋辽东栎5号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong5’ 山西省太行山国有林管理局坪松林场，良种编号：晋S-SS-QL-005-2014
Shanxi Province Taihang Mountain State Forest Administration, Pinsong Forest Farm, the code of improved variety: Jin S-SS-QL-005-2014Q6 晋辽东栎6号Querecus liaotungensis ‘Jinliaodong6’ 山西省关帝山国有林管理局真武山林场，良种编号：晋S-SS-QL-006-2014
Shanxi Province Guandi Mountain State Forest Administration, Pinsong Forest Farm, the code of improved variety: Jin S-SS-QL-006-2014Q7 蒙古栎1号Quercus monglica 1 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q8 蒙古栎2号Quercus monglica 2 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q9 蒙古栎3号Quercus monglica 3 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q10 蒙古栎4号Quercus monglica 4 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q11 蒙古栎5号Quercus monglica 5 吉林省引种种质The introduction of germplasm in Jilin Province Q12 猩红栎1号Quercus coccinea 1 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q13 猩红栎2号Quercus coccinea 2 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q14 猩红栎3号Quercus coccinea 3 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q15 猩红栎4号Quercus coccinea 4 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q16 猩红栎5号Quercus coccinea 5 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q17 猩红栎6号Quercus coccinea 6 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q18 北美红栎1号Quercus rubra 1 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q19 北美红栎2号Quercus rubra 2 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q20 北美红栎3号Quercus rubra 3 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q21 北美红栎4号Quercus rubra 4 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q22 北美红栎5号Quercus rubra 5 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina Q23 北美红栎6号Quercus rubra 6 美国北卡罗来纳州引种种质The introduction of germplasm in the United States North Carolina 
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表 2 SSR引物信息表
Table 2 Table of SSR primer information
引物名称
Primer name正向引物
Forward primer (5′→3′)反向引物
Reverse primer(5′→3′)ssrQrZAG 96 CCCAGTCACATCCACTACTGTCC GGTTGGGAAAAGGAGATCAGA ssrQrZAG 102 GCCTACACTCTTCAATCTACATGA GACTTGTAACACCTTAAGCATTATCT ssrQrZAG 112 TTCTTGCTTTGGTGCGCG GTGGTCAGAGACTCGGTAAGTATTC ssrQrZAG 7 CAACTTGGTGTTCGGATCAA GTGCATTTCTTTTATAGCATTCAC Qden 03011 AACCC AACCTTCCCTTCATC GCAGTGGTGCCTAATGTAGAC Qden 03021 ACAGCAAACCAGACTCCAC CCCCAAAGTTTCGGCTAATAC Qden 03032 AGTTGTGGTCCTGCTCGC GAAAAGTGCGATGACGGTTG Qden 05011 CCCACTCCCTGTCCATTGT CACTGTGTGCTGCGACTTG Qden 05031 CCCCGATTCGCCATCATTGT GTAACGCCGTTTTTCTCCACC
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表 3 9对SSR引物的多态检测
Table 3 Polymorphism detection of 9 pairs of SSR primer
引物名称
Primer name等位标记数
Allele number多态信息含量
PICssrQrZAG 96 8 0.76 ssrQrZAG 102 14 0.82 ssrQrZAG 112 8 0.77 ssrQrZAG 7 10 0.71 Qden 03011 7 0.65 Qden 03021 4 0.58 Qden 03032 7 0.78 Qden 05011 12 0.79 Qden 05031 8 0.72 总计Total 78 平均Mean 8.67 0.73
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表 4 23份种质的指纹图谱
Table 4 Fingerprint of 23 germplasms based on SSR markers
编号Code 指纹图谱Fingerprint Q1 ssrQrZAG96, 152, 152 ssrQrZAG112, 78, 90 ssrQrZAG7, 124, 140 Qden03011, 142, 144 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 174, 180 Q2 ssrQrZAG96, 154, 166 ssrQrZAG112, 81, 81 ssrQrZAG7, 134, 140 Qden03011, 140, 150 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 180, 188 Q3 ssrQrZAG96, 145, 150 ssrQrZAG112, 96, 98 ssrQrZAG7, 128, 138 Qden03011, 140, 140 Qden03021, 252, 256 Qden 05011, 176, 178 Q4 ssrQrZAG96, 150, 168 ssrQrZAG112, 90, 90 ssrQrZAG7, 126, 128 Qden03011, 140, 140 Qden03021, 252, 260 Qden 05011, 172, 180 Q5 ssrQrZAG96, 160, 186 ssrQrZAG112, 88, 90 ssrQrZAG7, 124, 124 Qden03011, 140, 142 Qden03021, 254, 256 Qden 05011, 176, 192 Q6 ssrQrZAG96, 154, 166 ssrQrZAG112, 90, 94 ssrQrZAG7, 126, 126 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 252, 260 Qden 05011, 180, 186 Q7 ssrQrZAG96, 147, 149 ssrQrZAG112, 88, 94 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 137 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 175, 183 Q8 ssrQrZAG96, 147, 151 ssrQrZAG112, 88, 88 ssrQrZAG7, 124, 124 Qden03011, 137, 137 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 175, 183 Q9 ssrQrZAG96, 147, 149 ssrQrZAG112, 88, 88 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 139 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 175, 175 Q10 ssrQrZAG96, 149, 149 ssrQrZAG112, 88, 98 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 139 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 177, 183 Q11 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 88, 88 ssrQrZAG7, 124, 134 Qden03011, 137, 139 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 175, 183 Q12 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 134, 146 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 185 Q13 ssrQrZAG96, 151, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 134, 146 Qden03011, 140, 142 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 185 Q14 ssrQrZAG96, 149, 149 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 130, 134 Qden03011, 138, 142 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 183, 185 Q15 ssrQrZAG96, 151, 151 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 130, 130 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 185, 185 Q16 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 130, 138 Qden03011, 140, 155 Qden03021, 256, 256 Qden 05011, 183, 185 Q17 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 96 ssrQrZAG7, 134, 138 Qden03011, 138, 138 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 183 Q18 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 94 ssrQrZAG7, 129, 131 Qden03011, 140, 142 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 183 Q19 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 127, 129 Qden03011, 136, 140 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 185, 185 Q20 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 134, 144 Qden03011, 138, 140 Qden03021, 252, 252 Qden 05011, 183, 183 Q21 ssrQrZAG96, 151, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 130, 134 Qden03011, 136, 136 Qden03021, 252, 254 Qden 05011, 183, 183 Q22 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 130, 134 Qden03011, 138, 142 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 174, 183 Q23 ssrQrZAG96, 149, 151 ssrQrZAG112, 92, 92 ssrQrZAG7, 124, 130 Qden03011, 142, 151 Qden03021, 254, 254 Qden 05011, 180, 183
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