高级检索

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

韩志强 任勇谕 夏宇飞 耿喜宁 杜康 康向阳

引用本文:
Citation:

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

    作者简介: 韩志强,博士。研究方向:细胞遗传与细胞工程。Email:zhiqiangybfq@163.com 地址:410004湖南省长沙市韶山南路498号.
    通讯作者: 康向阳,教授,博士生导师。主要研究方向:林木细胞遗传与细胞工程育种。Email:kangxy@bjfu.edu.cn 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

Construction of polymorphic SSR primer library and germplasm resource fingerprint database of Populus tomentosa

图(1)表(5)
计量
  • 文章访问数:  1121
  • HTML全文浏览量:  915
  • PDF下载量:  31
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-15
  • 录用日期:  2019-05-12
  • 网络出版日期:  2019-07-04
  • 刊出日期:  2019-07-01

毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建

    通讯作者: 康向阳, kangxy@bjfu.edu.cn
    作者简介: 韩志强,博士。研究方向:细胞遗传与细胞工程。Email:zhiqiangybfq@163.com 地址:410004湖南省长沙市韶山南路498号
  • 林木分子设计育种高精尖创新中心,林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083

摘要: 目的针对毛白杨优树种质资源形态学差异小、不易区分等问题,利用多态SSR引物构建优树种质资源指纹图谱,为毛白杨种质资源管理、新品种选育、知识产权保护等提供参考。方法本研究以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,从毛白杨SSR多态引物筛选入手,通过荧光SSR引物PCR扩增和毛细管电泳仪检测筛选SSR引物,并构建指纹图谱。结果在2 317对SSR引物中,共计得到清晰、特异、多态、稳定扩增的SSR引物406对,这些SSR引物在19条染色体上的分布数量介于3 ~ 39对之间,利用BLAST比对分析可将其中389对SSR引物定位到毛果杨基因组,构建了毛白杨优树种质资源多态SSR引物库。应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的技术策略,筛选出25对多态性较高的SSR核心引物,以及13对特异的SSR辅助引物,构建了毛白杨种质资源库内469个优良无性系指纹图谱库,并完成了指纹图谱的QR编码。结论本研究成功构建了毛白杨种质资源多态SSR引物库和优树无性系指纹图谱库,对与毛白杨类似的林木种质资源遗传变异研究以及品种鉴定、系谱分析等具有重要意义。

English Abstract

  • 毛白杨(Populus tomentosa)是中国特有的乡土树种,栽培和利用历史悠久,一直是黄河流域及华北平原地区用材林、农田林网和城乡绿化的主栽树种之一,也是重要的能源、纸浆、胶合板等用材树种[1]。20世纪80年代初,朱之悌组织中国10省研究人员开展毛白杨基因资源调查、选优和收集工作,建立了含1 047株源于优树根萌苗材料的“档案库”和850株源于优树花枝嫁接苗材料的“标本园”,在保存了日益减少的毛白杨基因资源同时,也为毛白杨的种质资源保护和遗传改良奠定了基础[2]。在我国近几十年来迅速发展的杨树育种工作中,育种学家们已经培育出了大量的优良新品种。然而,由于新品种的遗传基础较为狭窄,同时品种之间的形态学差异也越来越小,这给杨树知识产权保护和新品种的鉴定带来了困难。因此,对杨树新品种进行快速、准确地鉴别已成为目前急需解决的问题。

    DNA指纹图谱是品种纯度和真实性鉴定的有效途径,直接反映植物遗传物质在DNA分子水平上的差异[3],其中简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)标记具有多态性高、重复性好、共显性、多等位基因变异等优点,是动植物品种鉴定、系谱分析和遗传多样性分析等的有利工具[4],为利用现代分子生物学技术实现毛白杨种质资源准确、快速区分和有效管理提供了有利条件。随着毛果杨(P. trichocarpa)全基因组序列的发布,国际杨树基因组委员会公布了大量杨树SSR引物信息,为杨树DNA指纹图谱构建提供了便利条件。Dayanandan等最早开展了涉及36个美洲山杨(P. tremuloides)基因型的SSR分子标记研究[5]。随着分子生物学快速发展,尤其是毛果杨全基因组测序顺利完成,大量的杨树SSR引物信息于国际杨树基因组委员会的官方网站逐渐公布,促进了SSR标记在杨树中的应用,主要集中于美洲黑杨、欧洲黑杨及其杂种的遗传图谱构建[6]、品种指纹图谱构建[7]、系谱关系鉴定[8]等方面。但是,有关毛白杨多态SSR引物库和种质资源指纹图谱库构建等工作尚未见报道。

    目前,毛白杨优树种质资源库内尚保存选自9省的优树469个基因型[9],丰富的种质资源储备为毛白杨的遗传改良工作奠定了良好的基础。本论文基于为今后开展毛白杨群体遗传研究以及分子标记辅助选择育种提供公共资源和便利条件的目的,以山东冠县毛白杨种质资源库469个优树无性系为对象,采用TP-M13-SSR毛细管电泳自动检测法,筛选毛白杨SSR多态引物,构建毛白杨多态SSR引物库,以及涉及469份毛白杨优良无性系种质的指纹图谱库,为毛白杨种质资源库管理、品种鉴定以及知识产权保护和系谱分析等提供技术支撑,同时为杨树的育种工作奠定基础。

    • 1983—1984年,北京林业大学(中国,北京)组织全国省(市)毛白杨良种选育攻关协作组,在前期资源普查的基础上,从黄淮海流域100万km2(30° ~ 40°N、105° ~ 125°E)毛白杨分布区的10省100个县市,选取了1 047株毛白杨优树,于1986年建立山东省冠县毛白杨种质资源库。目前,种质资源库尚保存选自北京、河北、山东、河南、山西、陕西、甘肃、江苏和宁夏9省的优树469个基因型,包括75个雌性无性系、394个雄性无性系,其中天然三倍体28株[9]

    • 利用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co. Ltd, Beijing,China)进行毛白杨总DNA的提取。本研究根据Schuelke的方法共需要3种引物[10],包括5′端接有M13序列(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)的上游引物,普通的下游引物以及标有荧光(ROX, FAM, TAMRA, HEX)的M13引物。PCR具体程序如下:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,待测引物的最适退火温度30 s,72 ℃ 30 s共25个循环;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共8个循环;72 ℃ 8 min,4 ℃保存。PCR产物委托睿博兴科生物科技(北京)有限公司在ABI-3730XL基因分析仪上进行测试,其结果应用GeneMarker 1.75软件等[11],进行读取及分析。

    • 随机选取国际杨树基因组协会(International Populus Genome Consortium)公布的SSR数据库(IPGC;http://www.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)中的2 317对SSR引物为筛选对象。在上游引物5′端加以Ml3荧光染料标记,所有引物(上游引物,下游引物以及M13荧光标记引物)均委托北京睿博兴科生物技术有限公司进行合成。应用上述引物,以469个毛白杨优株DNA为模板进行TP-M13-SSR PCR,筛选在不同优树样本间具有多态性的引物。通过软件POPGEN VERSION 1.32计算所有多态性引物的等位标记位点数(Na)、有效等位标记数(Ne)、期望杂合度(He)、观察杂合度(Ho)、Shannon’s多态性指数(I)等遗传参数[12]

    • 利用CERVUS 3.0软件,进行个体鉴定以判断个体基因型在所鉴定群体中是否唯一,确认后参考马红勃等[13]和王静毅等[14]图谱代码构建方法编辑毛白杨无性系指纹图谱代码,即记录各毛白杨种质在每个SSR位点上的等位标记配置(略去单位bp,仅记录数字,并用“/”连接),再将SSR位点按固定顺序进行编码,SSR位点依次记为字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ、AK、AM,字母A前面数字1、2分别代表雌、雄。每个无性系的DNA经不同的引物扩增后将会形成由字母和阿拉伯数字组成的一系列编号,便形成了该无性系的SSR指纹图谱代码。即每一条字符串能唯一标识一份毛白杨无性系,可以将每一条字符串作为每一份无性系材料的分子身份证号码。

    • 应用QRCode转化工具进行编码,将各个无性系的名称、性别、类型、植物学分类和指纹图谱代码等情况录入该软件(https://www.the-qrcode-generator.com),形成指纹图谱QR编码。

    • 以469个毛白杨优株DNA为模板进行TP-M13-SSR PCR,在2 317对SSR引物中共计筛选到在不同优树样本间具有多态性的引物中有差异的稳定多态的SSR引物406对,初步完成了毛白杨多态SSR引物库的构建。如表1,引物库部分引物示例中信息包括引物序列,PCR产物碱基长度,以毛白杨DNA为模板的等位标记配置类型以及所在染色体具体位置。

      表 1  毛白杨优良无性系种质特异SSR引物库信息

      Table 1.  Specific SSR primer information of Populus tomentosa superior clonal germplasm

      引物
      Primer
      上游引物(5′−3′)
      Forward primer sequence (5′−3′)
      下游引物(5′−3′)
      Reverse primer sequence (5′−3′)
      染色体
      Chromosome
      位置a
      Locationa
      等位标记配置类型
      Allele configuration type
      GCPM_1053-1 AAAAATGATAACCAGGAAAAA TCGAGTTATCTCAGCCTCAT Chr01 14.84 188/196, 188/215, 186/188, 188/227, 188/188
      GCPM_1153-1 TTCCTTTCACACAATGACAA TTTAAAAACTGGGTCCGTAA Chr11 11.14 176/179, 179/182, 189/189, 171/174, 180/189
      GCPM_1056-1 CCACATTTATGTCCCTCTGT AAGCTGAAGCTGCTCTCTTA Chr06 11.08 134/134, 132/132, 144/144, 124/124
      GCPM_1063 AGTTAATTGCGCATGTTCTT AAACAAACTCCAGCAAACAT Chr05 6.00 166/187, 166/185, 166/191, 167/174
      GCPM_1065 TGCAATCATATATTCCTCCC ATAAAATTACTGCGTGCCAT Chr06 24.97 178/178, 184/184, 172/172, 163/163
      GCPM_1005-1 CTAAGTAGTGAAAGAGGCGG CTCCTGTAAATGTATCCCCA Chr18 0.26 123/123, 128/128, 121/121, 126/130
      GCPM_108-1 CTGCAAGATGTAAGTGATCG CAGCATTAGAGCCAAGCTA Chr18 15.09 121/121, 123/123, 126/126, 117/117
      GCPM_1120-1 TGCAAATCCAAACACAGATA ACGAATCATCTTACGCACTT Chr10 6.05 236/257, 245/245, 236/265, 236/260
      GCPM_1157-1 CCTCCTACCACATATTCCAA AGTGGTTAAAATGCGAGTGT Chr14 17.49 170/170, 173/175, 172/172, 170/175
      GCPM_122-2 GAAACCAGAAAGCAACAATC TGTTTCAACATCACCATGTC Chr02 1.05 201/206, 203/203, 206/206, 201/206
      GCPM_1223-1 CCTGAAGATGAAGATTTTGC TTGAAGTTTGAAGGGAGAAA Chr12 1.04 117/123, 114/117, 117/117, 117/122
      GCPM_1224-2 TGTCTTCTCTCTACAGCAAGG CACCGAGAAGAAACTTTCAG Chr09 11.04 153/153, 109/153, 112/153, 142/142
      GCPM_1033-1 TGAATTAAAGGTGGTGGTTC GGGTGAAATTGCATTTGTAT Chr16 9.83 223/230, 228/228, 230/230
      GCPM_1036-1 AAGTGGAATATTCGCCAAC GCTGGGATGGATCTAGAAA Chr01 35.79 163/163, 170/170, 172/175
      GCPM_1002-1 AAGAACCAGCACTTCCTGTA ATGACTAATCACTTGTGGGC Chr01 11.45 149/149, 159/168, 159/159
      GCPM_1054-1 AGGTCTGTGCAAGGAATAAA GTCTGTAATCAAGCCAAAGC Chr07 0.86 159/164, 159/166, 159/172
      GCPM_1224-1 AAAATGAATTGGCAGAAAGA GCTTCTTAGCTCAACCAGAA Chr09 11.04 196/216, 196/205, 196/207
      GCPM_1023-1 AGAAtAATTGTGGATGGACG TTTAATTGAGATTCGGGCTA Chr11 2.13 114/114, 110/110, 118/118
      GCPM_1175-1 TCATCAACCTGACCTCTACC CAAAGCAAAAACAAACACAA Chr14 13.38 190/209, 190/221, 193/196
      GCPM_1072-2 AGGAAAACAAAGGAGAGGAG ATGCTTAAAAGGGGATCTCT Chr06 4.20 141/146, 143/156, 152/157
      GCPM_11-1 TTGCTGTTAGCATCATTTTC TTGCTCTCTTTGTTGGAGAT Chr01 47.40 154/154, 151/151, 151/154
      GCPM_1116-1 GGGGCTAATATCAGTTTCCT TGAGAAAACCCTGGAAAATA Chr04 0.40 193/199, 199/199
      GCPM_1092-1 TTCTAAATATAAGAtAACC
      AATGAATG
      TATTCCCGCTTGTAATTCCT Chr01 4.82 217/217, 224/224
      GCPM_112-1 TTAGAGGAGAGAACTGCTGC TGGTCTGCAACACAAGATT Chr16 0.14 132/142, 128/132
      GCPM_1145-1 CTGAGAAATCCAACTCCTTG TACAGTAAGAAAGTGCTGCG Chr02 15.10 171/171, 191/191
      GCPM_1041-2 ATGACTTCATTGGGAAGAAA GACGATTTGGACTCCACTAA Chr13 14.59 167/167, 159/159
      GCPM_1079-1 CAAATTGGAGACTTCTCTGC TATTTCAATCTCCCATCGTC Chr05 20.82 222/222, 210/219
      GCPM_1184-1 TCTTGGCGAGAGAAGTAGAG GGATTTGGTGAAAATTGAAG Chr03 14.83 156/168, 154/164
      GCPM_1187-1 TGCTCTTGTATTGTTCCCTT TCTCAAGTAGGGTCCAGCTA Chr03 13.98 192/192, 189/189
      GCPM_1209-1 CGCTGTTGATGGATTACAA GAAAACATAGGAAAGTCGGA Chr12 12.35 132/137, 136/136
      GCPM_1220-1 ACTCTTGTTAAACCAAGCCA ACTACCTTTCTTCCCCTCAC Chr13 10.27 215/215, 204/215
      GCPM_1017-1 GTTTAATTCCCACGTCGTTA CGAATGAAGAAAAACCATTC Chr06 22.44 161/167, 169/173
      GCPM_1025-1 AAGGTGCTCCCACTTACTTT TGTGGCTAGGTAGTTTGGTT Chr03 10.31 135/230, 186/186
      GCPM_124 TTTGAGCACTTCAACTACCA TGTCTTCCCTTAGTCACCAC Chr01 6.33 205/208, 199/208
      GCPM_1242-1 TCGTGCAAATAAAAGCATTA ATGGATATTGTGCTCCTTTG Chr02 15.83 231/231, 229/229
      GCPM_1246 TCAAGTCAGAAACACTTCCA TTGATTCTATGGGTTTCACC Chr10 16.43 222/222, 222/236
      GCPM_1251-1 CTGCATTTGTTTCCTAATTTT AAAATGATAAGCTCGTTTGG Chr04 5.51 143/143, 130/130
      注:a表示SSR标记位点在染色体上的分布位置。Note: a SSR markers were distributed in chromosomes (size in Mb) of Populus.

      通过表2可知,引物库内定位到各染色体上的引物对数范围为7 ~ 39,其中有17对引物未能在基因组内定位。

      表 2  毛白杨多态SSR引物库基本信息

      Table 2.  Basic information of polymorphic SSR primer library in Populus tomentosa

      项目 Item    所在染色体 Chromosomal localization未定位引物 Unlocated chromosome
      染色体 Chromosome 1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
      引物对数 Number of primers 39 39 17 37 28 32 23 31 13 7 13 18 12 6 6 22 3 15 16 17
    • 利用初步筛选出的稳定变异等位标记的38对SSR引物对469个毛白杨优株无性系进行荧光标记毛细管电泳检测。由表3可知,38对SSR引物共检测出231个等位标记,不同引物扩增的等位标记数明显不同,可检测到有效等位标记数为2(LG_III-2)至14(GCPM_1571-1)个,平均每个引物6.079个等位标记。平均多态性信息含量(PIC)变动范围为0.034(ORPM-221)至0.569(PMGC_2606),平均值为0.378。平均期望(Ho)及观察杂合度(He)分别为0.601和0.427,Shannon信息指数(I)为0.106 ~ 1.225,每个引物平均值为0.770(表3),说明这套引物有较好的鉴别能力。其中,引物PMGC_2606、GCPM_112-1、GCPM-2012、GCPM_1072-2、GCPM_1063为鉴定效率最高的引物,PIC大于0.5,等位变异数范围为7 ~ 14,在以后毛白杨DNA指纹数据库的构建中应重点应用。

      表 3  38对SSR核心引物信息表

      Table 3.  38 pairs of SSR core primer information

      编号
      No.
      引物
      Primer
      引物序列(5′−3′)
      Primer sequence (5′−3′)
      NaNeI杂合性
      Heterozygosity
      鉴定效率
      Identification efficiency
      PICHoHe区分种质数
      Distinguishing germplasm number
      区分率
      Distinguishing rate/%
      1 GCPM_1571-1 F: AAGAAGGGTGGTAAGCTTTT 14 1.694 0.958 0.392 0.054 0.410 81 17.27
      R: TCCGTAGATCTCTCTCCAAA
      2 GCPM_1063 F: AGTTAATTGCGCATGTTCTT 11 2.492 1.160 0.520 0.990 0.599 60 14.74
      R: AAACAAACTCCAGCAAACAT
      3 PMGC_2606 F: AATTTACATTTCTTTATCATCACC 10 2.756 1.225 0.569 0.990 0.638 50 12.29
      R: GCTGTCTAACATGCCATTGC
      4 GCPM_1411-1 F: TCAACGACTTTTTCATTGTG 10 1.476 0.778 0.312 0.206 0.323 48 11.79
      R: AGCATTCTTGCTGGTGTTAT
      5 PMGC_2571 F: TCTCGCAGATTCATGTAACCC 10 2.360 1.048 0.491 0.941 0.577 50 12.29
      R: GACTGTATGTTGACCATGCCC
      6 GCPM_1184-1 F: TCTTGGCGAGAGAAGTAGAG 9 1.696 0.913 0.389 0.435 0.411 39 9.58
      R: GGATTTGGTGAAAATTGAAG
      7 GCPM_1504-1 F: AGGTCTGTGCAAGGAATAAA 9 2.400 1.078 0.497 0.995 0.584 41 10.07
      R: GTCTGTAATCAAGCCAAAGC
      8 GCPM_1072-2 F: AGGAAAACAAAGGAGAGGAG 8 2.677 1.198 0.558 0.966 0.627 35 8.60
      R: ATGCTTAAAAGGGGATCTCT
      9 PMGC-2818 F: AAGCTTCATCGTCCTGCTTG 8 2.171 0.903 0.435 0.872 0.540 33 8.11
      R: CGTATCAATTCACGACTCTCG
      10 GCPM_112-1 F: TTAGAGGAGAGAACTGCTGC 7 2.647 1.168 0.548 0.990 0.623 25 6.14
      R: TGGTCTGCAACACAAGATT
      11 GCPM-2012 F: GGTGATGAAGATCTGGGATA 7 2.549 1.067 0.528 0.980 0.608 24 5.90
      R: ACCCAAATTACAGAACAACG
      12 GCPM_88-1 F: TAAACTGCTTTTAGTTGCCC 7 1.088 0.230 0.080 0.025 0.081 21 5.16
      R: TCCATGTTGTGTGATCTGAG
      13 PMGC_2088-2 F: TCACAAAAGGTTAACGACTTCG 7 1.381 0.561 0.254 0.017 0.276 24 5.89
      R: CAGTACTCAGCTGCAGGTCC
      14 GCPM_2627-1 F: TAAGTCCCACTACACCCAAC 6 2.325 0.950 0.477 0.995 0.571 20 4.91
      R: GAGTTCGAGAGAGGGAATCT
      15 LG_V-2 F: AAAGAAACCAGACCACACAC 6 2.312 0.967 0.473 0.995 0.568 19 4.67
      R: CGCTTGCCTTAATTAACAGT
      16 GCPM-2768 F: CAGCAAAATCATCACAAATC 6 2.136 0.852 0.422 0.988 0.532 19 4.67
      R: AGGGTTTGGTAGAGAAGACC
      17 GCPM_2570-1 F: AACCCACTTCCTCTCTCTGT 6 2.362 0.996 0.495 0.928 0.577 19 4.67
      R: TGAGACTTCCGACTCGTAG
      18 LG_VIII-3 F: ATCCGACTTCGATATCTTCA 6 1.544 0.698 0.328 0.032 0.353 20 4.91
      R: CTACCTGAAACACAGGAAGC
      19 GCPM_1153-1 F: TTCCTTTCACACAATGACAA 6 1.381 0.633 0.265 0.273 0.276 18 4.42
      R: TTTAAAAACTGGGTCCGTAA
      20 GCPM_3652-1 F: TAAACTGCTTTTAGTTGCCC 6 1.069 0.180 0.065 0.015 0.065 18 4.42
      R: TCCATGTTGTGTGATCTGAG
      21 PMGC_223 F: CGATGAGGTTGAAGAAGTCG 5 2.309 0.939 0.472 0.831 0.568 14 3.44
      R: ATATATGTACCGGCACGCCAC
      22 GCPM_3474-1 F: GATCCGAAAACAACAACAAT 5 2.212 0.901 0.445 0.985 0.549 13 3.19
      R: ACCCCTTTCTCTTCTCAATC
      23 GCPM-124 F: TTTGAGCACTTCAACTACCA 5 2.045 0.757 0.391 0.993 0.512 11 2.70
      R: TGTCTTCCCTTAGTCACCAC
      24 LG_XVI-9 F: CTCGCAGCTCTTCTCATAGT 5 2.326 0.953 0.476 0.946 0.571 13 3.19
      R: CCTACCCATTTATGACCAAA
      25 PMGC_2140 F: GCTGTCAGAATCAAACACTTC 5 1.405 0.617 0.274 0.197 0.289 11 2.70
      R: AAGCAGATAACTAAGACATGCC
      26 GCPM_1056-1 F: CCACATTTATGTCCCTCTGT 5 1.485 0.589 0.288 0.017 0.327 13 3.19
      R: AAGCTGAAGCTGCTCTCTTA
      27 ORPM-221 F: TGGAGGCTGTCTGTTTTGTG 5 1.035 0.106 0.034 0.0074 0.034 10 2.26
      R: AGATTTGAGCGACTCCGAAA
      28 GCPM_1832-1 F: TTACTTGCTAGCTGCCAATC 5 1.222 0.428 0.176 0.039 0.182 10 2.46
      R: CCTAAAAGTTTGTCTATGCGA
      29 LG_XVI-7 F: ACAAATCAAAGTCACAGCCT 4 2.201 0.861 0.441 0.985 0.546 8 1.97
      R: ATAGTGTTCAATCGGACCTG
      30 GCPM_1572-2 F: TGTTGTGGATTGTGATTAGG 4 2.074 0.781 0.402 0.995 0.519 9 2.21
      R: ACACTTCCAAACAGAACACC
      31 LG_VIII-4 F: ATCTTTCAAGAAGCTTGACG 4 1.125 0.240 0.106 0.017 0.112 7 1.72
      R: AGCATTCTTGCTGGTGTTAT
      32 GCPM_3367-1 F: CAGGACATTTAACTCCTTCG 4 1.110 0.236 0.096 0.015 0.099 8 1.97
      R: TTAAGTCCTCAACAGAGGGA
      33 GCPM_XIX-11 F: CAACATGAAATGAGCTGCTA 3 2.043 0.746 0.391 0.872 0.511 10 2.46
      R: TCCACATGATGTCTGATTTG
      34 GCPM_1524-1 F: TTCAATGGAAAGGGATAATG 3 2.359 0.933 0.485 0.961 0.577 9 2.21
      R: TCATTTGTAAAACATCACGC
      35 LG_XVI-6 F: ATAGCGATCATCAAAGGAAA 3 2.295 0.906 0.470 0.985 0.565 8 1.97
      R: AAATATTCATGTGGAGGCAC
      36 LG_IX-1 F: CCAACTTCAATGCTAGGAAC 3 2.260 0.894 0.463 0.948 0.558 5 1.06
      R: TGGTAAGCCTGAGGATACAC
      37 ORPM_197 F: GTCAGTTTGCCCTCTTCGTC 2 1.380 0.447 0.237 0.138 0.275 3 0.74
      R: TGAGGGCGTCTCCTCTTTTA
      38 LG_III-2 F: ATTGATTATATTTGCCGCAT 2 1.244 0.347 0.177 0.202 0.197 2 0.49
      R: TGGACATCTCACTACCTTCC
      均值 Average value 6.017 1.912 0.770 0.378 0.601 0.427
      注:Na. 等位标记数量;Ne. 有效等位标记数量;I. Shannon’s信息指数;Ho. 观察杂合度;He. 期望杂合度;PIC. 多态性信息含量。Notes: Na, number of alleles per locus; Ne, effective number of alleles; I, Shannon’s information index; Ho, observed heterozygosity; He, expected heterozygosity; PIC, polymorphism information content.

      Shannon’s指数和PIC均高于平均值的引物25对,PMGC_2606、GCPM_112-1、GCPM-2012、GCPM_1072-2、GCPM_1063、PMGC_2571、GCPM_1504-1、GCPM_2570-1、PMGC_223、GCPM_1571-1、GCPM_1411-1、GCPM_2627-1、LG_V-2、GCPM_1524-1、LG_XVI-6、LG_XVI-9、PMGC-2818、GCPM-2768、LG_XVI-7、GCPM_1572-2、GCPM_3474-1、GCPM_XIX-11、LG_IX-1、GCPM-124、GCPM_1184-1。25对SSR引物可区分的种质从5份到78份不等,平均为26.4份。区分率最高的引物是GCPM_1571-1(17.27%),最低的为LG_IX-1(1.06%)。

      利用CERVUS 3.0软件进行个体鉴定,确认每一个基因型在所鉴定的种质资源库内是唯一的。选取No.1—No.5号引物,鉴定其对毛白杨种质的区分率,可以区分156份毛白杨种质,区分率为33.17%;其次是No.1—No.10号引物组合,可以区分262份毛白杨种质,区分率为55.77%;再次是No.1—No.15号引物组合,可以区分361份毛白杨种质,区分率为76.97%;No.1—No.20号引物组合,可以区分448份毛白杨种质,区分率为95.52%(表4)。继续增加引物对数,将No.1—No.25号引物组合在一起,可以区分的毛白杨种质数量增加到456份,区分率为97.29%,已基本将材料区分开。以上25对引物可以作为毛白杨种质鉴定的核心引物。此时,仍有13个毛白杨种质不能够相互区分,参考以13份毛白杨种质为模板的等位变异的SSR引物,进一步增加引物的数量,直至再增加13对,总引物数增加为38对时,可全部区分469份毛白杨种质。这样,在增加13对辅助引物后,区分率达到100%。

      表 4  毛白杨指纹图谱构建最佳引物组合筛选

      Table 4.  Optimum primer combination applied to construction of the fingerprint of Populus tomentosa

      引物组合
      Primer combination
      鉴定效率
      Identification efficiency
      区分种质数
      Distinguishing
      germplasm number
      区分率
      Distinguishing rate/%
      No.1—No.5 156 33.17
      No.1—No.10 262 55.77
      No.1—No.15 361 76.97
      No.1—No.20 448 95.52
      No.1—No.25 456 97.29
      No.1—No.30 463 98.77
      No.1—No.38 469 100.00
    • 对引物进行组合以鉴定组合引物的区分率,利用CERVUS 3.0软件明确38个SSR标记可建立469份毛白杨优株无性系的DNA指纹图谱。标记LG_III-2、GCPM_2570-1、PMGC_2606、ORPM_197、PMGC_2140、PMGC_223、LG_IX-1、LG_VIII-3、GCPM_112-1、GCPM_2627-1、LG_VIII-4、GCPM_1504-1、GCPM_1411-1、LG_V-2、GCPM_1153-1、GCPM_1524-1、LG_XVI-6、LG_XVI-9、PMGC-2818、GCPM-2768、LG_XVI-7、GCPM-2012、GCPM_1832-1、GCPM_3367-1、GCPM_88-1、GCPM_3652-1、GCPM_3474-1、GCPM_XIX-11、GCPM_1571-1、GCPM_1572-2、GCPM_1072-2、PMGC_2088-2、GCPM_1184-1、GCPM_1063、GCPM_1056-1、PMGC_2571、ORPM-221、GCPM-124依次记为字母A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V、W、X、Y、Z、AA、AB、AC、AD、AE、AF、AG、AH、AI、AJ、AK、AM,记录每份材料经不同的38对SSR标记扩增出现的等位标记碱基长度(bp),依据试验之前设计的指纹图谱代码构建方法,为469份供试材料建立能够相互区别于其它供试材料的指纹图谱代码(表5)。例如无性系2-3,指纹代码第一个数字1,代表其为雌株,A391/396代表位点LG_III-2的等位标记配置为391 bp/396 bp,以此类推。

      表 5  毛白杨优株无性系SSR指纹代码

      Table 5.  SSR fingerprint code of Populus tomentosa superior clones

      编号 No.SSR指纹代码 SSR fingerprint code
      2-3 1A391/396B236/246C165/184D206/206E191/191F178/178G388/388H237/237I133/143J237/257K387/387L157/164M242/242N196/207O180/189P170/173Q115/130R221/234S138/140T194/196U352/368V126/138W152/152X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/398AC178/178AD118/118AE151/157AF185/185AG153/163AH166/191AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      314 1A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/175Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      3-3-4 2A396/396B236/246C165/184D206/208E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M220/236N196/207O180/180P170/173Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      3000-4 1A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/173Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB405/405AC178/178AD118/123AE185/185AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      6319 2A396/396B236/246C165/184D206/206E191/191F176/178G388/405H237/237I131/133J237/257K387/387L157/162M236/236N196/207O180/180P170/170Q115/130R218/221S138/140T194/204U352/364V129/138W156/156X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/405AC178/178AD118/123AE148/151AF185/185AG153/153AH166/185AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209
      注:本表格只示例部分毛白杨优株无性系指纹代码。Note: only part of the clone fingerprint code of Populus tomentosa is showed in this table as example.
    • 利用QRCode转化工具对所有毛白杨优株无性系材料指纹图谱代码进行转换,为每份毛白杨种质构建一份二维指纹代码图(图1),图1中仅列举了18个毛白杨优株无性系材料的二维指纹图谱代码图,QR编码中包含了毛白杨优株无性系编号、毛白杨优株无性系性别、毛白杨优株无性系类型、毛白杨优株无性系植物学分类、毛白杨优株无性系指纹图谱代码等信息。图1中毛白杨优株的QR编码中2-3包含以下信息,物种:毛白杨;名称:2-3;种源:山东;性别:雌;倍性:二倍体;植物学分类:杨柳科杨属白杨组;指纹代码如下:1A391/396B236/246C165/184D206/206E191/191F178/178G388/388H237/237I133/143J237/257K387/387L157/164M242/242N196/207O180/189P170/173Q115/130R221/234S138/140T194/196U352/368V126/138W152/152X121/121Y145/145Z144/144AA121/133AB398/398AC178/178AD118/118AE151/157AF185/185AG153/163AH166/191AI146/146AJ106/118AK220/220AM205/209。

      图  1  毛白杨优株无性系指纹图谱QR编码

      Figure 1.  Fingerprinting QR codes of Populus tomentosa superior clones

    • SSR分子标记是检测种质资源遗传信息的有效工具,直接反映植物遗传物质在DNA分子水平上的差异,具有多态性高、重复性好、共显性、多等位标记变异等优点,能有效检测DNA水平上的遗传变异,并提供大量的遗传变异信息[15]。本研究中构建了由406对SSR引物组成的毛白杨多态SSR引物库,其中包括引物在染色体上的定位以及等位标记的片段大小等信息,首次为毛白杨品种鉴定、系谱分析和遗传多样性评价等提供了可供参考的SSR引物公共资源。

    • 选择合适的引物是建立动植物分子指纹图谱进而构建其分子身份证的重要前提[16]。构建种质资源的指纹图谱,要求用最少的引物对数区分最多的种质[17]。本研究首先筛选出稳定的多态SSR引物406对,初步完成了毛白杨多态SSR引物库的构建。在此基础上,采取应用多态性较高的SSR核心引物,以及特异的SSR辅助引物相结合的策略,完成毛白杨优树种质资源指纹图谱库核心引物的筛选。在SSR引物库构建中首先进行了多态性较高的SSR核心引物筛选,主要依据获得的多态SSR引物对毛白杨种质鉴别的区分率,引物扩增等位标记数、Shannon’s指数、多态性信息含量(PIC)等指标,从5对引物开始,由高到低选择多态性高的SSR引物,并逐步增加引物组合的数量,直至再增加多态性SSR引物也难以显著增加鉴别材料数量为止,以获得可对毛白杨种质资源库大多数无性系实现鉴别的引物组合,达到以最少的引物区分最多的种质的目的。本研究筛选25对高多态性SSR核心引物,可鉴别毛白杨种质资源库中469个优树无性系的97.29%,即456个优树无性系。此外,SSR引物库构建还应用了部分多态性不高的引物,主要是由于随着供试材料的增加,会出现诸多相同SSR位点而难以检测差异的材料,尤其是变异极少的材料,此时继续采用Shannon’s指数及多态性信息较高的SSR引物已难以显著提高种质的区分率。因此,从足够多的毛白杨多态SSR引物库中筛选一些特殊差异位点而获得少数特异种质材料可鉴别的指纹图谱,即通过筛选添加毛白杨特异的SSR辅助引物,达到区分全部毛白杨种质的目的。本研究在筛选了25对高多态的核心SSR引物的基础上,同时也应用了13对特异的SSR辅助引物,实现了毛白杨种质资源库469个优良无性系指纹图谱构建,为今后毛白杨遗传资源管理、品种鉴定、系谱分析和知识产权保护等奠定了基础。

    • QR编码QR Code 属于矩阵式二维条码,为日本Denso 公司研制,是一种新型图形符号自动识读处理码制。QR Code 是目前应用最广泛的二维条码之一(Denso wave. QRCode Features [EB/OL]. http://www.densowave.com/qrcode/index-e.html,2010−12−20)。本研究在构建毛白杨种质资源库469个优良无性系指纹图谱的基础上,进一步构建了指纹图谱QR编码。指纹图谱代码易于理解,但其包含信息量少。而指纹图谱QR编码虽然比较抽象,但是可以录入较多相关信息,所包含的信息量较大,可以随时修改,只需对QR编码进行解码,即可得到种质相关信息,具有高效、方便等特点,有利于毛白杨种质鉴定工作的高效开展。

参考文献 (17)

目录

    /

    返回文章
    返回